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您可以在目标蛋白中添加或去除多个标签,以帮助您进行实验设计。
并非所有标签都一样:它们有着不同的优势和局限性。在某些情况下,您可能既需要一个提高蛋白可溶性的标签,又需要一个进行纯化的标签。这时,就可以通过一种称为串联亲和纯化 (TAP)的过程来实现。TAP 最初是指将一系列特定的结构域融合到一种蛋白上:钙调蛋白结合肽 (CBP) 和来自金黄色葡萄球菌(ProtA)的蛋白 A,被烟草蚀纹病毒 (TEV) 切割位点隔开1。尽管经常会包含一个原始 TAP 的组分,但是,这一技术现在已可用于将 2 至 3 个不同标签融合到您的目标蛋白上。这些标签可串联添加到蛋白的一端,也可融合到蛋白的每个末端。如果标签使用后需要切割,通常建议将标签串联融合,以便切割。
His 标签由于体积较小且纯化效果好,因此是 TAP 的热门之选。它们通常与麦芽糖结合蛋白 (MBP) 结合,可增加溶解度,并降低在大肠埃希菌系统中形成聚集体的可能性2。另一个常见的组合是 GFP 和 His,该组合可以通过荧光方法检测蛋白3。
尽管使用 TAP 标签有诸多优点,但它们体积大,可能会干扰蛋白的功能。此外,如果您正在使用含 CBP 的标签,那么可能会干扰钙信号1。由于每种标签都有其特定优势,您可能希望在蛋白中添加多个标签。根据经验,标签数量不应超过目标蛋白数量。
一些标签对蛋白功能产生影响的风险很小,但另一些标签,尤其是那些大分子的标签,会对下游产生影响。因此,通常需要在初始检测后对目标蛋白的标签进行切割。标签的切割可以利用位点特异性蛋白酶或内含肽来实现。
位点特异性蛋白酶不应影响蛋白的功能,但通常需要在切割后去除蛋白酶。一种解决方案是使用一种自身已融合到亲和标签中的蛋白酶。然后通过亲和色谱法轻松去除蛋白酶4。根据您的具体需求,可以存在多个蛋白酶识别位点,每个位点都有明显的优势和局限性。需要考虑的一点是,应将标签融合到 N 端还是 C 端。
切割 N 端的标签,目标蛋白上剩下的过量残基最少。但是,切割 C 端的标签,则会在目标蛋白上留下 4-6 个多余残基。在特定情况下,也可使用羧肽酶去除这些较短的 C 端序列1。我们在下方列出了最常见的蛋白酶位点。
肠激酶
切割位点:DDDDK^X
优势:DDDK (FLAG®) 标签中存在内部识别位点
局限性:赖氨酸残基后的氨基酸不同,则效力不同,范围为 61%(X = 脯氨酸)至 88%(X = 丙氨酸)。可在非特异性位点进行切割。
因子 X
切割位点:I(E/D)GR^X
优势:来源广泛。
局限性:氨基酸“X”不能是精氨酸或脯氨酸。因子 X 可结合钙离子,因此,不应与螯合剂(如 EDTA)一起使用。可在非特异性位点进行切割。
SUMO 蛋白酶(酿酒酵母 Ulp1)
切割位点:识别 SUMO 的三级结构。在融合蛋白的 N 端切割。
优势:可在广泛的缓冲液条件 (pH 5.5-10.5) 和温度 (4-37°C) 范围下使用。可在 2 M 尿素中使用,有助于纯化包涵体中 SUMO 标记的蛋白。
局限性:效力取决于目标蛋白的序列,例如,如果切割位点后有一个脯氨酸,效力就会降低。
切割位点:ENLYFQ^S
优势:可广泛重组生产,确保能以相对较低的成本进行特异性切割。可于低温下以及在多种 pH 值的缓冲液中使用。切割位点后的残基非常灵活,因此可使用目标蛋白的原生 N 端残基,且不会损失效力6。
局限性:野生型 TEV 蛋白酶会自行切割,因而会降低效力。切割位点:LVPR^GS
优势:特异性相对较强,可在存在去污剂的情况下使用。可使用苯胺琼脂糖有效清除。
局限性:切割发生在非特异性位点的情况较为罕见,通常是由于商业制剂中的污染物所致。
切割位点:ETLFQ^GP
优势:4°C 下活性最佳
局限性:在较高温度下,效力会降低。
有效的亲和标签可将几丁质结合域 (CBD) 与修饰后的内含肽序列相结合。尽管洗脱步骤需要蛋白水解切割,但标签和树脂的结合很牢固7。