敲除 (KO) 验证：确认抗体特异性
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为了确保您拥有高特异性的抗体，我们通过 CRISPR/Cas9 基因组编辑使用 KO 验证，为您提供研究所需的可靠结果。
需求
抗体是生命科学和临床研究中研究蛋白质及其在各种生物途径和疾病中功能的最常用工具之一。抗体的特异性和敏感性有助于鉴定不同表达水平的目的蛋白。越来越多的研究表明，并非所有的抗体都是特异性的，因此实验的不可再现性问题日益严重。这种再现性问题在某种程度上是由交叉反应和脱靶蛋白结合导致的。这些非特异性抗体导致资源浪费，并妨碍科学进步（Bradbury & Plückthun, 2015 年；Baker, 2015 年；Mullane 等人，2015 年）。
解决方案：敲除验证
接受度最广且最受信任的抗体特异性验证过程之一是敲除 (KO) 验证（Madhusoodanan, 2014 年；Rhodes & Trimmers, 2008 年）。KO 验证是一项非常稳健的技术，可在不表达目的蛋白的 KO 细胞系或组织中通过检测目的抗体来确证其特异性。
如果将 KO 细胞系数据与来自野生型 (WT) 细胞系的数据进行比较，则特定抗体在 KO 细胞系中不应产生信号，但在 WT 细胞系中会产生特定信号。以这种方式，KO 验证作为真正的阴性对照，以确认抗体对目标蛋白的特异性（Bordeaux 等人，2010 年）。
我们使用 Horizon Discovery 提供的通过 CRISPR/Cas9 生成的广泛人类 KO 单倍体细胞系库。这种类型的 KO 细胞系提供了来自单个等位基因 KO 的完全功能丧失表型，并消除了在二倍体细胞模型中观察到的来自第二个等位基因的敲除的任何掩盖（Bürckstümmer T 等人，2013 年；Reiling JH 等人 2011 年；Carette JE 等人 2009 年）
敲除验证试验结果
通过 KO 验证我们的抗体时，我们主要使用 western blot 来评估结果。以下是来自我们抗体检测的不同类型的 western blot 结果，以及我们处理这些结果的方式。
特异性
- 结果：KO 样本中的预期分子量 (MW) 条带消失。
- 下一步：将基于 KO 的特定数据添加到数据表中。通过 KO 试验保证抗体的特异性。
图1： Cdk4 RabMAb® 产品 - ab108357。KO 样本中正确分子量 (MW) 的预期条带消失。
所有泳道：1/1000 稀释度的抗 Cdk4 兔单克隆抗体 [EPR4513] (ab108357)
泳道1： 野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2： Cdk4 敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小： 34 kDa
预定条带大小： 34 kDa
加载对照品（红色条带）：1/1000 稀释度的抗 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
部分特异性 – 额外条带
- 结果：KO 样本中预期 MW 条带消失，但存在不同 MW 的额外条带。
- 下一步：我们将基于 KO 样本的特定数据添加到数据表中。将进行更多的研究和检测，以鉴别额外的条带。
图2： Cdk6 小鼠单克隆产品 - ab54576。KO 样本中正确 MW 的预期条带消失，因此可识别其预期靶标。然而，在 WT 和 KO 样本中也存在额外条带。这可能是由于它与其他家族成员/亚型或不相关的蛋白质有交叉反应。
所有泳道： 1/1000 稀释度的抗 Cdk6 抗体 (ab54576)
泳道1：野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2：Cdk6 敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小：37 kDa
预定条带大小：37 kDa
加载对照品（红色条带）： 1/1000 稀释度的抗 β 肌动蛋白抗体 (ab8227)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗兔 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性 – KO 样本中的弱信号
- 结果：与 WT 样本相比，预期 MW 条带仍然存在于 KO 样本中，强度较低。一种基准抗体在 WT 样本中解析目标条带，在 KO 样本中未解析条带。
- 下一步：我们将基于 KO 样本的特定数据添加到数据表中。将进行更多的研究和测试，以确定 KO 样本中信号背后的原因。
图3： Akt1 RabMAb® 产品 - ab32038。KO 样本中存在正确分子量的预期条带，但强度低于 WT 样本。然而，它可能与与靶蛋白分子量相同的其他家族成员/亚型发生交叉反应。
所有泳道： 1/1000 稀释度的抗 Akt1 兔单克隆抗体 (ab32038)
泳道1： 野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2：Akt1 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小：55 kDa
预定条带大小：55 - 60 kDa
加载对照品（红色条带）： 1/1000 稀释度的抗 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性 – KO 样本中的信号
- 结果：KO 样本中仍存在预期的 MW 带，强度与 WT 样本相同。一种基准抗体在 WT 样本中解析目标条带，在 KO 样本中未解析条带。
- 下一步：我们从目录中删除抗体，并且我们建议使用已确认特异性的替代抗体。
图4： Akt1 兔多克隆产品 - ab91505。KO 样本中仍存在预期的 MW 带，强度与 WT 样本相同。基准标志物显示，WT 样本中有目标条带，KO 样本中无条带。
所有泳道:抗 Akt1 兔多克隆抗体 (ab91505)，1:1000
泳道1：野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2：Akt1 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小： 55 kDa
预定条带大小：55 - 60 kDa
加载对照品（红色条带）：1/1000 稀释度的抗 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性 – KO 和 WT 样本中均无目标条带
- 结果：未在 WT 和 KO 样本中识别出目标条带。一种基准抗体在 WT 样本中解析目标条带，在 KO 样本中未解析条带。
- 下一步：我们从目录中删除抗体，并且我们建议使用已确认特异性的替代抗体。
敲除验证的抗体：我们的承诺
当您看到 KO 验证标记时，即可确信该抗体不仅在推荐的应用和种属中得到了验证，而且其特异性已经通过我们的内部 KO 验证方法得到确证。