基因敲除 (KO) 验证：确认抗体特异性
为了确保您拥有高度特异性的抗体，我们通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑使用 KO 验证，为您提供研究所需的可靠结果。
目录
抗体是生命科学和临床研究中最常用的工具之一，用于研究各种生物学通路和疾病中的蛋白质及其功能。
好的抗体具有靶标特异性和灵敏度，即使在低表达水平下也能识别目的蛋白。但是，越来越多的研究表明，并非所有抗体都具有靶标特异性，也有许多抗体表现出与脱靶蛋白的交叉反应性。从而导致实验不可重复性这一公认问题。1这些非特异性抗体会导致资源浪费，并妨碍科学进步。2,3
解决方案：敲除验证
接受度最广且最受信任的抗体特异性验证过程之一是基因敲除 (KO) 验证。4 KO 验证是一项非常稳健的技术，可在不表达目的蛋白的 KO 细胞系或组织中通过检测目的抗体来确证其特异性。
在 KO 细胞系中测试特异性抗体时，特异性抗体不会产生信号，但在野生型 (WT) 细胞系测试特异性抗体时，特异性抗体会产生特异性靶蛋白信号。以这种方式，KO 验证作为真正的阴性对照，以确认抗体对目标蛋白的特异性。4,5
Abcam 使用广泛的人 KO 单倍体细胞系库来进行抗体验证。这些 KO 细胞系通过 CRISPR-Cas9 生成，并通过 Sanger 测序鉴定。这种类型的 KO 细胞系提供了来自单个等位基因 KO 的完全丧失功能的表型，并消除了在二倍体细胞模型中观察到的来自第二个等位基因对敲除的任何掩盖。6-8
基因敲除验证试验结果
当 KO 验证我们的抗体时，我们主要使用 western blot 来评估结果。KO 验证可产生一系列 western blot 结果，以下示例给出了我们处理这些结果的方式。
特异性抗体
- 结果：KO 样本中的预期分子量 (MW) 条带消失。
- 下一步：将基于 KO 的特定数据添加到数据表中。通过 KO 验证保证抗体的特异性。
图1： Cdk4 RabMAb® 产品 (ab108357)。KO 样本中正确分子量 (MW) 的预期条带消失。
所有泳道：1/1000 稀释度的 Cdk4 兔单克隆抗体 [EPR4513] (ab108357)
泳道1： 野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2： Cdk4 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小： 34 kDa
观测条带大小： 34 kDa
内参对照品（红色条带）：1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
部分特异性抗体 - 额外条带
- 结果：KO 样本中预期 MW 条带消失，但存在不同 MW 的额外条带。
- 下一步：我们将基于 KO 样本的特定数据添加到数据表中。将进行更多的研究和检测，以鉴别额外的条带。
图2：Cdk6 小鼠单克隆产品 (ab54576)。KO 样本中正确MW 的预期条带消失；因此，抗体可识别其预期靶标。然而，在 WT 和 KO 样本中也存在额外条带。这可能是由于抗体与其他蛋白家族成员/亚型或不相关的蛋白质有交叉反应。
所有泳道：1/1000 稀释度的 Cdk6 抗体 (ab54576)
泳道1：野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2：Cdk6 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小：37 kDa
观测条带大小：37 kDa
内参对照品（红色条带）：1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8227)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗兔 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体 – KO 样本中的弱信号
- 结果：与 WT 样本相比，预期 MW 条带仍然存在于 KO 样本中，强度较低。一种基准抗体在 WT 样本中解析目标条带，而在 KO 样本中未解析出条带。
- 下一步：我们将基于 KO 样本的特定数据添加到数据表中。将进行更多的研究和测试，以确定 KO 样本中信号背后的原因。
图3：Akt1 RabMAb® 产品 (ab32038)。KO 样本中存在正确 MW 的预期条带，但强度低于 WT 样本。然而，该抗体可能与样本中分子量与目标蛋白相同的其他蛋白家族成员/亚型有交叉反应。
所有泳道：1/1000 稀释度的 Akt1 兔单克隆抗体 (ab32038)
泳道1：野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2：Akt1 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小：55 kDa
观测条带大小：55 - 60 kDa
内参对照品（红色条带）：1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体 – KO 样本中的信号
- 结果：KO 样本中仍存在预期的 MW 带，强度与 WT 样本相同。一种基准抗体在 WT 样本中解析目标条带，而在 KO 样本中未解析出条带。
- 下一步：我们从目录中删除抗体，并推荐使用已确认靶标特异性的替代抗体。
图4：Akt1 兔多克隆产品 (ab91505)。KO 样本中仍存在预期的 MW 带，强度与 WT 样本相同。使用基准抗体会在 WT 中显示目标条带，而在 KO 样本中无条带。
所有泳道：Akt1 兔多克隆抗体 (ab91505)，1:1000
泳道1：野生型 HAP1 细胞裂解液
泳道2：Akt1 基因敲除 HAP1 细胞裂解液
预测条带大小：55 kDa
观测条带大小：55 - 60 kDa
内参对照品（红色条带）：1/1000 稀释度的 β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗：
IR 染料 800 山羊抗兔 IgG (H + L)
IR 染料 680 山羊抗小鼠 IgG (H + L)
均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体 - KO 和 WT 样本中均无目标条带
- 结果：该抗体未在 WT 和 KO 样本中识别出目标条带。一种基准抗体在 WT 样本中解析目标条带，而在 KO 样本中未解析出条带。
- 下一步：我们从目录中删除抗体，并且我们建议使用已确认特异性的替代抗体。
基因敲除验证的抗体：我们的承诺
当看到 KO 验证标记时，您可以相信该抗体不仅在推荐的应用和种属中得到了验证，而且其特异性也已经通过我们内部 的KO 验证方法得到了确认。
基因敲除细胞系和裂解液：已编辑好，为您做好了准备
我们应用 CRISPR-Cas9 技术开发了广泛的 KO 细胞系和裂解液，从而为您提供可靠的抗体，节省您的时间和金钱。每个 KO 细胞系都是单独克隆并通过 Sanger 测序验证的，同时内附亲代 WT 对照裂解液，用于在一致的细胞背景下评估基因敲除的生物学影响。
参考文献
- Bradbury A and Pluckthun A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518:27-29 (2015).
- Baker M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521:274-276 (2015).
- Mullane K, Enna SJ, Piette J, Williams M. Guidelines for manuscript submission in the peer-reviewed pharmacological literature. Biochem Pharmacol. 97(3):225-35 (2015).
- Zhong Z, Sassi M, Heaton S, Koch S, De Block G, Conlon D, Lochead J, Dreja H, Munro M, Solache A, Hamilton B. Large-scale use of knockout validation to confirm antibody specificity. J Immunol 200 (1 Supplement) 120.18 (2018).
- Bordeaux J, Welsh AW, Agarwal S, Killiam E, Baquero MT, Hanna JA, Anagnostou VK, Rimm DL. Antibody Validation. Biotechniques. 48(3):197–209 (2010).
- Bürckstümmer T, Banning C, Hainzl P, Schobesberger R, Kerzendorfer C, et al. A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells. Nat Methods. 10(10):965-71 (2013).
- Reiling JH, Clish CB, Carette JE, Varadarajan M, Brummelkamp TR, Sabatini DM. A haploid genetic screen identifies the major facilitator domain containing 2A (MFSD2A) transporter as a key mediator in the response to tunicamycin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(29):11756-65 (2011).
- Carette JE, Guimaraes CP, Varadarajan M, Park AS, Wuethrich I, et al. Haploid genetic screens in human cells identify host factors used by pathogens. Science. 326(5957):1231-5 (2009).