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KD 值:抗体亲和力的定量测定

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            KD 值和抗体亲和力指南。

            ​我们已经系统地测定了超过 840 种 RabMAb 抗体(Abcam 的兔单克隆抗体系列)的 KD 值(抗体及其抗原之间的平衡解离常数),用以评估其个体 KD 值,并观察 RabMAb 抗体的平均亲和力。与已发表文献载明的小鼠单克隆抗体值的比较结果显示,RabMAb 抗体的亲和力平均提高了 1-2 个数量级(图 1)。

            ​图 1:RabMAb 抗体与小鼠单抗 的 KD 分布对比:本次对比选用的 88 种小鼠单抗的 KD 值来自已发表的文献。每种小鼠单抗的 KD 值可能都已经使用了多种方法和步骤进行了单独测定。863 种 RabMAb 抗体的 KD 值均通过 OI-RD 测定项目测定。

            ​什么是 KD?它与抗体亲和力和敏感性有何关系?

            KD 是抗体与其抗原之间的平衡解离常数,即 koff/kon 的比。KD 与亲和力成反比。KD 值与抗体的浓度(特定实验所需的抗体量)有关,因此 KD 值越低(浓度越低),抗体的亲和力越高。

            KD 值

            摩尔浓度(敏感性)

            10-4 至 10-6

            微摩尔(µM)

            10-7 至 10-9

            纳摩尔(nM)

            10-10  至 10-12

            皮摩尔(pM)

            10-13  至 10-15

            飞摩尔(fM)

             表 1:KD 和摩尔值

            KD 值如何测定?

            ​相关测定与加州大学戴维斯分校物理系 J. Landry 和 X. Zhu 合作完成。OI-RD(斜入射反射率差)以及亲和力数据的数据处理、数据分析和报告生成在加州大学戴维斯分校物理系测定,并在发布前交由 Abcam 的科学家进行了测定置信度审查。

            ​阅读有关此新型抗体 KD 测定方法的详细信息。​​

            如何读取 KD 值

            ​为了确保您能够查看各抗体的 KD  测定值,已在各抗体产品页添加各抗体的特定 KD 值和对应图示。​​

            ​​

            ​​

            ​​图 2:KD 值图表说明:

            1. ​基线 - 无抗体
            2. ​缔合反应 (Kon) - 该反应旨在计算“缔合速率”(Kon),用于表征抗体与其靶标结合速度的常数。零时注入特定浓度的抗体溶液,并在肽微阵列上运行 15 分钟。
            3. 解离反应 (Koff) - 该反应旨在计算“解离速率”(Koff),用于表征抗体与其靶标解离速度的常数。

              斜率平缓 = 解离速率缓慢/抗体结合较强

              下降趋势明显 = 解离速度较快/抗体结合较弱

              在虚线处,将溶液换回空缓冲溶液并运行肽微阵列。

            4. ​每种抗体采用多种不同的浓度进行测试,每种浓度对应图中的不同颜色曲线。此外,每个肽点均加倍印刷在微阵列上,从而形成单独的曲线。
            5. ​实验测定的解离和缔合速率 (Koff/Kon) 用于计算 KD 值。​

            KD 值-FAQ

            1. KD 值代表什么?如何计算?
            2. KD 值和抗体亲和力之间是什么关系?
            3. 抗体的典型 KD 值是多少?理想的 KD 值是多少?
            4. KD 值如何测定?
            5.  该方法与其他 KD 测定方法(如 Biacore)相比表现如何?


            KD  值代表什么?如何计算?

            ​KD 系指抗体从其抗原解离的速率 (koff)与抗体与抗原缔合的速率 (kon) 之间的比值。网站上列出的 KD  值系通过测定特定抗体/抗原相互作用的 kon 和 koff,然后根据所得值之间比率确定的。

            KD 值和抗体亲和力之间是什么关系?

            ​亲和力系指单个分子与其配体结合的强度,通常通过平衡解离常数 (KD) 进行测定和报告,平衡解离常数可用于评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。抗体与其抗原的结合是一个可逆的过程,结合反应的速率与反应物的浓度成正比。​​

            平衡时,[抗体] [抗原]复合物的形成速率与其解离成其组分[抗体] + [抗原]的速率相等。测定反应速率常数可定义平衡或亲和力常数 (1/KD)。简而言之,KD 值越小,抗体对其靶标的亲和力越大。

            抗体的典型 KD  值是多少?理想的 KD 值是多少?

            ​大多数抗体的 KD 值都在低微摩尔 (10-6) 至纳摩尔 (10-7 至 10-9) 范围内。人们通常认为,高亲和力抗体处于低纳摩尔范围内 (10-9),而亲和力非常高的抗体处于皮摩尔范围内 (10-12)。采用 OI-RD 进行 850 多次测定后得出,RabMAb 抗体的中值 KD 值约为 7 x 10-11 M,表明 RabMAb 抗体普遍具有很高的亲和力。

            KD 值如何测定?

            ​KD 值采用加州大学戴维斯分校物理系 James Landry 博士和 Xiangdong Zhu 博士开发的新型无标记检测系统测量。这是一个基于微阵列的系统,并且结合了基于偏振调制斜入射反射率差 (OI-RD)(参考)的无标记光学扫描仪。

            了解 OI-RD 方法。


            该方法与其他 KD 测定方法(如 Biacore)相比表现如何?

            ​使用 OI-RD 或 Biacore 仪器对六个独立的抗体-抗原对进行动力学测量。在该实验中,双倍抗原被捕获到固体支持物上。通过注射四种浓度的 RabMAb 抗体产生结合数据。用于拟合实验数据的模型为 1-比-1 Langmuir,并使用整体曲线拟合分析。比较分析结果汇总参见表 2 和图 2。结果表明,各分析方法之间具有极好的相关性,并且在一个数量级内。

            抗体

            OI-RD KD (M)

            Biacore KD (M)

            EGFR

            8.5E-12

            1.9E-11

            Glut-1

            2.4E-11

            7.7E-12

            CD34

            4.1E-11

            1.2E10

            Glucagen

            7.0E-11

            3.3E-10

            Cytokeratin 15

            2.5E-10

            5.6E-10

            表 2:使用 OI-RD 和 Biacore 获得的 KD 测定结果比较。

            参考文献

            • ​Fei Y, Sun YS, Li Y, Lau K, Yu H, Chokhawala HA, Huang S, Landry JP, Chen X and Zhu X (2011). Fluorescent labeling agents change binding profiles of glycan-binding proteins. Mol BioSyst, 7 3343-3352.
            • Landry JP, Fei Y and Zhu X (2012). Simultaneous Measurement of 10,000 Protein-Ligand Affinity Constants Using Microarray-Based Kinetic Constant Assays. Assay Drug Dev Tech, 10, 250-259.
            • Landry JP, Fei Y and Zhu XD (2012). High throughput, Label-free Screening Small Molecule Compound Libraries for Protein-Ligands using Combination of Small Molecule Microarrays and a Special Ellipsometry-based Optical Scanner. International Drug Discovery, 6, 8-13.
            • Landry JP, Sun YS, Guo XW and Zhu XD (2008) Protein reactions with surface-bound molecular targets detected by oblique-incidence reflectivity difference microscopes. Appl Opt, 47, 3275-3288.
            • ​Landry JP, Zhu XD and Gregg JP (2004). Label-free detection of microarrays of biomolecules by oblique-incidence reflectivity difference microscopy. Opt Lett​, 29, 581-583.
            • Sun YS, Landry JP, Fei YY, Zhu XD, Luo JT, Wang XB and Lam KS (2008). Effect of Fluorescently Labeling Protein Probes on Kinetics of Protein-Ligand Reactions. Langmuir​, 24, 13399-13405.
            • Zhu XD, Landry JP, Sun YS, Gregg JP, Lam KS and Guo XW (2007). Oblique-incidence reflectively difference microscope for label-free high-throughput detection of biochemical reactions in a microarray format. Appl Opt, 46, 1890-1895.


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