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要想获得准确、精确的结果,需要使用始终能够特异性、选择性地与预期靶点结合的抗体。抗体验证 只对特定的应用有效;有关抗体已在哪些应用中进行验证的信息,可查看抗体数据手册中的“已测试应用”部分。
在这里,您将进一步了解到我们在特定应用验证过程中开展的操作。
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开发夹心 ELISA 时,需要认真选择配对抗体对(检测抗体和捕获抗体),确保两种抗体均能与靶蛋白特异性结合。由这些抗体组成的抗体对,其筛选性能对这些抗体的验证而言至关重要。只有对靶点显示出高特异性、选择性和连续的稀释线性的抗体组合才能用于进一步开发。
我们通过加标回收率实验来验证抗体选择性,并在血浆、血清或组织裂解液中验证各抗体对的性能。这种方法需要将纯化的重组靶蛋白“加标”到生物基质中,然后在试剂盒提供的稀释液中进行回收和检测,并确保其信号在试剂盒预测的蛋白标准品信号 -/+ 20% (80–120%) 的范围内变化。在生物基质和对我们的 ELISA 试剂盒有效的样本基质的标准稀释液中观察到的加标回收率应几乎相同。
样本稀释线性研究也采用夹心 ELISA 进行,用以确保我们的抗体对不仅可以识别纯化的重组蛋白,而且可以识别天然靶蛋白。为此,我们会在一系列稀释液中平行测定标准蛋白和蛋白的天然信号。如果标准蛋白和天然信号均按比例稀释,则在校正稀释后,利用插值法得到的样本值在所有测试剂量下均应相同。判定靶蛋白的浓度时,用稀释因子乘以计算得出的浓度即可(图 1)。
图 1.人 PSA SimpleStep® ELISA 试剂盒定量测定细胞培养物、血清、血浆和尿液中人前列腺特异性抗原 (PSA) 时的稀释线性。稀释样本一式两份进行测定,计算得出的浓度乘以稀释因子即为最终浓度。
为了进一步验证用于 ELISA 的抗体的特异性,我们对抗体与相关蛋白或其家族成员的结合程度进行了测试。测试结果可以用来判定是否存在任何交叉反应和干扰。例如,为了确认用于 ELISA 的 CXCL2 抗体具有特异性,我们使用 CXCL3 和 CXCL1 进行了测试,CXCL3 和 CXCL1 分别与 CXCL2 具有 82% 和 63% 的氨基酸相同性。在此情况下,相关家族成员蛋白的吸光度值与背景吸光度值相似。为了确定种属反应性,我们还会检查不同种属(即小鼠、兔、山羊、大鼠等)的相同蛋白,以便确认抗体对人类蛋白具有特异性。我们可以接受的交叉反应性在 5% 以下。
我们的抗体对和 ELISA 试剂盒中的抗体采用重组技术生产。这意味着我们的抗体对和 ELISA 试剂盒一开发出来就具有很高的批间一致性。
在 western blot 中验证抗体时,我们会使用确定能够表达目标蛋白的细胞或组织的裂解液。确定好要使用的合适裂解液后,我们就会运行 western blot,并核查条带大小和预期分子量。我们每次都会在同一 western blot 实验中运行多个对照,包括阳性裂解液和阴性裂解液(如有可能,图 2)。
此外,我们还会尽可能加入 基因敲除 (KO) 细胞系,作为 western blot 真正的阴性对照。我们还在不断增加已提供的KO 验证抗体 的数量。此外,我们还会对旧存货和新批次进行对比。如果我们认为旧的库存产品仍然有效,还会用它来做合适的阳性对照。
如果 western blot 得到一条清晰干净的条带,并且对照泳道的结果也令人满意,这些抗体就会通过验证并被添加到产品目录中。
图 2.所有泳道:p53 抗体 [DO-1] – ChIP 级 (ab1101)。泳道 1:野生型 HAP1 细胞裂解液 (20 µg)。泳道 2:p53 基因敲除 HAP1 细胞裂解液 (20 µg)。泳道 3:A431 细胞裂解液 (20 µg)。泳道 4:Saos-2 细胞裂解液 (20 µg)。使用山羊抗小鼠 IgG H&L (IRDye® 800CW) 预吸附抗体 ab216772 检测到抗体结合。图像显示存在合并信号(红色和绿色)。绿色:在 53 kDa 处观察到 ab1101。红色:使用山羊抗兔 IgG H&L 二抗 (IRDye® 680RD) ab216777 在 37 kDa 处观察到 GAPDH 内参对照 ab181602。
IHC 和 ICC 可以根据细胞和亚细胞的定位判定抗体是否识别了正确的蛋白。抗体的特异性则通过观察在同一组织中表达或不表达靶蛋白的细胞进行确认。首先,我们的科学家会查阅现有文献,确定用于验证的最佳细胞系和组织。然后,我们会通过 IHC/ICC 来查看蛋白表达情况,确定细胞定位是否符合预期(图 3)。如果信号位置符合预期,该抗体即通过验证,并且被认为适用于 IHC/ICC。
开发抗体过程中,我们使用了多种方法,包括对多个正常人体组织微阵列 (TMA)、多肿瘤人 TMA 及大鼠或小鼠 TMA 进行染色。这些高通量阵列可以让我们同时检查多个组织,但前提是所有组织都暴露在完全相同的条件下。
我们目前正在努力尝试使用 KO 细胞系进行 ICC 验证。
图 3.人扁桃体福尔马林固定石蜡包埋组织切片 IHC 染色图像 - PD-L1 抗体 (ab205921)。切片用苏木精复染、上蓝、脱水、透明处理并用 PDX 封片。
肽阵列是一种非常高通量的抗体验证方法,可以一次性测试抗体对 500 多种肽的特异性(图 4)。测试 组蛋白修饰抗体 时,我们主要使用的是肽阵列,因为它可以让我们检查不同修饰之间的交叉反应性。
我们按照六种不同的稀释度使用液体处理系统对肽进行稀释,然后将每种稀释度的肽一式三份转印到硝酸纤维素载玻片上,用于同时评估一种抗体对这些肽的结合特异性。
我们分析的每张硝酸纤维素载玻片都包含多种必需的阳性和阴性对照,用以评估抗体特异性。我们会同时检测旧的库存产品批次和新的抗体测试批次,以便作并排比较。我们还会对自己的抗体和外部的竞争抗体批次进行肽阵列验证,从而比较两类抗体的性能。
图 4. ab176916 在肽阵列中与 501 种不同的修饰和未修饰组蛋白肽的交叉反应性测试;每种肽均采用 6 种不同的浓度(一式三份)转印到阵列上。圆形区域代表抗体与肽之间的亲和力:所有含抗原的肽用红色圆圈标示,其他肽均采用蓝色圆圈标示。基于相应的肽浓度绘制抗体结合值时,亲和力按照曲线下的面积计算。每个圆形区域都代表亲和力最强的肽。
使用肽阵列之前,我们通常会先用 dot blot 来验证我们的组蛋白修饰抗体。我们网站上的许多组蛋白修饰抗体仍然包含 dot blot 验证信息,表明它们适用于 dot blot。
该项技术的原理与肽阵列类似,都是将几种肽连续稀释后点样到硝酸纤维素上,然后根据对照肽判定目标抗体的特异性(图 5)。
图 5.使用 ab176916 及山羊抗兔 IgG H&L (HRP) (ab97051) 标记的组蛋白 H3(三甲基 K9)肽(泳道 1)、组蛋白 H3K9 未修饰肽(泳道 2)、组蛋白 H3(巴豆酰基 K4)肽(泳道 3)和组蛋白 H3K4 未修饰肽(泳道 4)的 dot blot 分析。
现在,我们已经很少使用 dot blot 验证最近的抗体批次了,因为我们的内部肽阵列效率更高,可以一次性验证抗体对数百种肽的特异性。偶尔,我们还会使用 dot blot,但仅用于确认我们得到的肽阵列数据。
批量测试抗体时,我们不会将 IP 作为常规测试项;但是,我们会根据需要对个别抗体开展 IP 测试。
验证用于 IP 的抗体时,我们会使用磁珠进行标准 IP 实验方案,因为我们发现这些磁珠可以在更短的时间内得到更好的结果。分离出目标蛋白后,我们会同时在 western blot 中分析上清液和 IP 流出液。此外,我们还会在同一 western blot 中测试每种裂解液的无抗体的对照和仅含磁珠的对照。这时,我们希望通过 IP 样本得到一条符合预期蛋白大小的干净条带。我们还会检查 blot 的其他泳道,查看可能出现在阴性对照中的非特异性结合(图 6)。
图 6.使用 ab228415 从 0.35 mg NCI-H1975(人非小细胞肺癌细胞系)全细胞裂解液中对 PD-L1 进行免疫沉淀。使用 ab228415 对免疫沉淀物进行 western blot。使用 VeriBlot for IP Detection Reagent (HRP) (ab131366, 1/5,000) 开展检测。泳道 1:NCI-H1975 全细胞裂解液 10 µg (Input)。泳道 2:NCI-H1975 全细胞裂解液中的 ab228415 IP (+)。泳道 3:兔单抗 IgG (ab172730) 代替 NCI-H1975 全细胞裂解液中的 ab228415 (-)。
ChIP 测试是在我们的组蛋白修饰抗体上开展的。利用肽阵列完成抗体特异性验证以后,再使用 ChIP 测试我们的抗体能否下拉与 DNA 复合的蛋白质靶点。
开展 ChIP 实验时,我们使用的是提取自福尔马林交联的 HeLa 细胞或小鼠 NIH/3T3 细胞的染色质。用我们的标准 ChIP 实验方案进行 ChIP 实验,并且会使用一组引物作为每种组蛋白修饰的已知阳性和阴性对照基因座,然后通过 qPCR 测试抗体的下拉性能,从而得到我们的抗体在活性和非活性基因组控制区域的结合情况(图 7)。
图 7.根据 Abcam X-ChIP 实验方案,利用 HeLa(来自人宫颈腺癌细胞的上皮细胞系)细胞制备染色质。使用 25 µg 染色质、2 µg ab45173(蓝色)和 20 µL A/G 琼脂糖珠浆(10 µL 琼脂糖 A 珠 + 10 µL 琼脂糖 G 珠)开展 ChIP。向对照磁珠(黄色)中加入兔正常 IgG。通过实时 PCR(TaqMan 方法)定量测定免疫沉淀的 DNA。
抗体通过验证前,我们会检查 ChIP-qPCR 得到的图谱是否符合我们的预期,也就是说我们的乙酰化组蛋白修饰抗体是否与基因组上的活性区域进行了结合(图 7)。我们还会测试新批次的下拉强度,并与之前的批次进行比较,以确保各批次之间的下拉能力一致。
每次开展 ChIP 验证实验时,我们都会使用多种标准对照,包括 IgG 阴性对照和仅含磁珠的阴性对照。除了用来控制 q-PCR 的阳性和阴性基因座,我们还会在每个验证实验中添加空白阴性对照。
目前,我们正在进一步开发我们的 ChIP 方法和 ChIP 验证方案,并且正在努力验证产品目录中更多的抗体。
验证用于流式细胞术的抗体时,我们会认真优化染色方案的每一个步骤,包括固定、通透和洗涤。为了实现这一目的,我们的科学家会查阅现有文献,了解哪些细胞类型和条件最适合验证特定的抗体。
我们会添加相关对照,一般来说有未染色对照、阳性对照、阴性对照、同型对照、活性对照、Fc 阻断对照、荧光扣除对照 (FMO) 和单染色对照。对于 FMO 对照,除正在测试的样本外,我们会用荧光偶联物对所有样本进行染色。这样可以显示其他荧光偶联物对未标记通道信号的贡献。这种对照在判定抗体的非特异性结合方面起着重要作用。
同型对照是一种很好的阴性对照,它可以帮助我们从特异性抗体结合产生的信号中分辨出背景信号。这些对照使用的是与您正在验证的一抗同型相匹配,但对靶点没有特异性的一抗。我们还在流式细胞术验证中使用了多种可供使用的 KO 细胞系。如果抗体在流式细胞术中显示的是阳性信号,并且通过了我们的所有对照实验,我们将出售这种抗体,并说明它适用于流式细胞术。
掌握抗体与靶标的结合特异性至关重要。我们通过持续的基因敲除 (KO)-验证项目来验证抗体特异性,该项目使用单倍体细胞模型的 CRISPR/Cas9 KO 人类细胞系。敲除模型是真正意义上的阴性对照,是抗体验证的绝佳标准品。
基因敲除模型通过观察基因功能缺失的表型来了解特定基因的功能,这正是该模型的强大之处。过去的一年,我们一直与 Horizon Discovery 合作对 500 余种抗体进行敲除验证,还将 200 种非特异性抗体从我们的产品目录中移除。敲除验证仅是我们为提高抗体质量标准所采取的众多步骤之一。
图 8.PD-L1 RabMAb (ab205921) 免疫组化特异性测试 - 基因敲除 (KO) 测试。使用 PD-L1 抗体在人肺腺癌细胞系 L2987 中观察到明显的 IHC 检测信号。使用靶向人 PD-L1 转录变体 1 (NM_014143.3) 外显子 4 的 TALEN 构建体编辑 L2987 细胞中的 PD-L1 基因,对克隆体 L2-14 进行深度测序,确认基因完全敲除。在 L2987 L2-14 KO 细胞系中完全检测不到 IHC 信号。
图 9.PD-L1 RabMAb (ab205921) 流式细胞术特异性测试 - 基因敲除 (KO) 测试。使用靶向人 PD-L1 转录变体 1 (NM_014143.3) 外显子 4 的 PD-L1 TALEN 构建体检测到明显信号,对克隆体 L2-14 进行深度测序,确认基因完全敲除。在 L2987 L2-14 KO 细胞系中几乎观察不到细胞表面染色。
为了确保使用不同批次的相同抗体能够获得相同、准确的结果,我们开展了一致性测试,评估批间差异。
重组抗体的批间一致性非常高,因此您几乎不需要进行额外的批间优化(例如滴定实验)。但采用杂交瘤技术生产的其他非重组型单抗和多抗则不同,它们的内部变异程度较高。
当可用且适用时,重组单抗在检测开发中更受青睐,它能提供最高的批间一致性(图 8)。
图 10.PD-L1 RabMAb (ab205921) IHC 批量测试 – 分析表达 CHO PD-L1 的细胞。A:兔 IgG,5 µg/mL 未染色。B:PD-L1 抗体,2 µg/mL(批次 1)。C:PD-L1 抗体,2 µg/mL(批次 3)。D:PD-L1 抗体,2 µg/mL(批次 4)。E:PD-L1 抗体,2 µg/mL(批次 5)。F:PD-L1 抗体,2 µg/mL(批次 6)。G: PD-L1 抗体,2 µg/mL(批次 7)。所有批次(1、3、4、5、6、7)结果一致。