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从最佳应用的确定到常见问题的辨别,我们的指南可以帮助您充分利用您的实验时间。
本指南中的章节:
融合标签简介
突出显示目标蛋白的原因有很多:例如想要观察其细胞定位,或对其进行纯化结晶。虽然许多蛋白都有市售抗体,但有时很难制造出针对某一靶蛋白的特异性抗体。为了克服这些问题,科学家们开发了一种广泛的融合标签分子工具箱。
融合标签是一种已知的蛋白或多肽,可融合到目标蛋白上。由于这些标签已得到充分表征,可供选择购买的优质抗体范围较广,因此能够在各类应用中轻松检测特定蛋白。将已知序列连接至蛋白的最常用方法是使用重组 DNA 技术,即将目标蛋白的 DNA 导入含有融合标签序列的质粒中。该质粒在表达时,融合标签会附连接到蛋白上 [图 1]。
除了考虑使用哪种标签,还应仔细考虑连接序列。连接序列可以将目标蛋白连接到标签,这一过程对确保正确的蛋白正确折叠和功能非常重要。连接序列分为刚性、柔性或可剪切序列,与融合标签一样,每种序列都具备不同的特性1。
图 1:首先,将目标蛋白和融合标签的 DNA 都插入到质粒中。然后对其进行转录和翻译,从而产生附着在融合标签上的目标蛋白。
优点
缺点
融合标签主要分为三类,适用于不同的应用:表位标签、亲和标签和荧光标签。
表位标签往往是短肽序列,可用于免疫学应用,如 Western Blot 和免疫共沉淀。
亲和标签一般较长,可用于蛋白纯化或增加蛋白溶解度。
荧光标签可用于活细胞和死细胞,并广泛用于影像学研究,如细胞定位和共表达实验。
选择将标签融合到目标蛋白的 C 端还是 N 端,很大程度上取决于蛋白本身:蛋白的折叠方式,以及您选择的末端是否有功能要求。例如,如果 C 端在蛋白内部折叠,那么您收到融合蛋白信号的可能性非常小;或者,如果蛋白在标签融合末端进行翻译后剪切,那么标签将从目标蛋白中移除。
如果您有资源或准备开展新型实验,最好同时克隆 C 端和 N 端标签的构造,从而确定最佳选择。一研究小组发现,与 N 端的标签融合蛋白相比, 更多的C端融合蛋白定位于目标亚细胞腔隙2。但是,需要强调的是,虽然 C 端标签蛋白的定位和表现往往符合预期,但并不是始终可以预测。融合蛋白定位是否正确,可通过免疫荧光进行检测;免疫印迹有助于确认融合蛋白的大小是否正确并以预期的水平表达,免疫共沉淀有助于评估融合蛋白与已知底物的相互作用方式3。
如欲了解详细信息,请查看以下页面:
如果您考虑使用多个应用或需要移除标签,请阅读有关串联亲和纯化和标签剪切的详细内容。
如欲了解有关标签检测的详细信息,请访问检测和应用页面。
是否应该使用某种特异性标签?
很遗憾,对于哪种标签或融合位置最适合您的实验这一问题,并没有明确的答案。我们建议您根据自己的目标和应用以及我们的指南选择起点4。
可考虑以下关键问题:
我需要在活细胞中观察蛋白。应该使用哪种标签?
如果您想在活细胞中观察蛋白,请使用荧光标签。可以使用的荧光标签有很多种,可根据需要检测多种蛋白。查看荧光标签页面,了解更多信息。
我想观察蛋白定位。应该使用哪种标签?
我们提供针对多种标签的优质一抗,但通常使用的是表位标签。阅读表位标签页面,了解更多信息。
哪些标签最适合纯化?
虽然有多种标签可用于纯化,但最常用的是亲和标签。阅读亲和标签页面,找出最适合您应用的亲和标签。
如果标签不起作用,我该怎么办?
如果您一开始没有获得最佳结果,可尝试改变标签的位置、改变或添加一个蛋白酶位点、修改连接序列或附加多个标签,从而利用每个标签的特性。此外,我们还在不断开发新型标签,旨在实现特定目的,或者在现有标签的特定属性的基础上进行改良。
哪里能查找常见标签的分子量?
您可以使用我们的图表来比较常见亲和标签、表位标签和荧光标签的分子量。
亲和标签
表位标签
标签 | 序列/序列长度 |
---|---|
c-myc | EQKLISEEDL |
HA | YPYDVPDYA |
DDDK, 或 Flag® (Sigma) | DYKDDDK |
T7 | MASMTGGQQMG |
V5 | GKPIPNPLLGLDST |
VSV-G | YTDIEMNRLGK |
Glu-Glu | EYMPME 或 EFMPME |
S 标签 | KETAAAKFERQHMDS |
References