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亲和标签广泛用于获得高产率的优质蛋白。
亲和标签之所以这样命名,是因为它们经常被用于亲和纯化:一种从细胞裂解液中纯化出蛋白的技术。将亲和标签连接到目标蛋白上,可通过与固定化底物的化学或物理相互作用,将其从溶液中分离出1 [图 1]。具体使用何种亲和层析方法,取决于所用的特定标签。本节介绍了一些最常用的亲和标签。
图 1:该图显示了亲和层析的步骤。首先,将您的样本进行裂解,以释放蛋白。向色谱柱添加裂解液时,融合标签会与亲和树脂结合。通过色谱柱清洗多余蛋白后,即可洗脱目标蛋白。
分子量:~26 kDa
大小:211 个氨基酸。
标签位置:C-端 或 N-端
亲和树脂:谷胱甘肽
应用:蛋白纯化、蛋白-DNA 相互作用、蛋白间相互作用。
优势:有助于溶解和稳定融合蛋白结构。
局限性:标签相对较大,因此会对融合蛋白的功能造成影响。洗脱液可能会被热休克蛋白污染。
概述
谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 是一种由 211 个氨基酸组成的蛋白,分子量约为 26 kDa1。天然 GST 负责保护细胞免受有害化合物和氧化应激的影响。GST 的一个主要特性是其对三肽(谷胱甘肽)具有亲和性,可在亲和层析中使用。含有 GST 的溶液在经过内衬固定化谷胱甘肽的色谱柱时,GST 会与谷胱甘肽结合,将其与溶液的其余部分分离。建议使用接近中性的缓冲液,以便 GST 与固定化谷胱甘肽实现最佳结合1,3。结合后,可以用 10 mM 谷胱甘肽洗脱 GST。10 mM 谷胱甘肽是一种温和的洗脱剂,有助于保留融合蛋白功能2。
蛋白功能丧失:由于 GST 是一个大标签,可在溶液中自然二聚化,因此可能会降低蛋白的活性或功能。这一问题可通过蛋白酶(如凝血酶、Xa 因子或 PreScission)从您的目标蛋白中切割 GST 来解决 - 阅读我们的串联亲和纯化和标签切割页面,获得与蛋白酶相关的详细信息。该步骤可在结合谷胱甘肽色谱柱时进行。
变性 GST:如欲将 GST 与谷胱甘肽柱结合,需要正确折叠 GST4。因此,应使用低浓度的变性剂或还原剂:2-3 M 尿素、<10 mM 2-巯基乙醇或 2% v/v 吐温 20。
分子量:0.2-1.6 kDa.6x-His 标签为 0.8 kDa。
大小:2-10 个组氨酸残基
标签位置:C 端或 N 端,或内部。
亲和树脂:过渡金属离子,通常为 Ni2+
应用:蛋白纯化
优势:体积小,因此影响融合蛋白功能的可能性较低。不会产生包涵体。
局限性:在哺乳动物和昆虫细胞中可能会有显著的背景结合。
概述
PolyHis 标签由于体积小且结合稳定,因而广泛用于蛋白纯化1,2,3,4。尽管标签可以是 2-10 个组氨酸残基,最常见的 His 标签为 6x-His 标签或 hexatag,后者包含 6 个组氨酸残基。组氨酸会与固定化过渡金属离子形成配位键,这一特性可用于蛋白纯化。虽然钴和锌色谱柱都可用于固定化金属亲和层析 (IMAC),但通常使用镍柱。虽然标签的最佳位置具有蛋白特异性2,但由于 His 标签是短肽序列,它们很少影响融合蛋白的特性。
注意事项:
内源性 His:由于哺乳动物和昆虫系统中普遍存在 His 残基,因此使用这些系统时可能出现较高的背景。可以通过在 5-10 mM 咪唑中清洗来避免背景结合,但这样可能导致目标蛋白过早洗脱。使用 His 抗体时也应考虑背景结合。
使用具有金属中心的蛋白:不建议将具有金属中心的蛋白与 His 标签融合,因为金属可能会被亲和树脂吸收。
厌氧条件:应避免厌氧条件,因为其可能会削弱亲和树脂。
产品 | Abcam ID |
---|---|
6X His 标签®抗体 [4D11] | ab5000 |
His-标签蛋白纯化色谱柱(预先包装,5 x 1 mL)- AminTrap | ab270528 |
His-标签蛋白纯化色谱柱(预先包装,5 x 5 mL)- AminTrap | ab270529 |
分子量:244 Da
亲和树脂:亲和素/链霉亲和素
应用:蛋白纯化、表面等离子共振、蛋白表达。
优势:对亲和素和链霉亲和素具有强亲和力。
局限性:在哺乳动物系统中可能会遇到与其他生物素标记蛋白共洗脱的情况。
概述
生物素又称维生素 H,是一种分子量为 244 Da 的小分子物质。它是一种常用的分子工具,常与二抗偶联,用作 ELISA 和 Western Blot 检测的可视化技术。生物素能够与链霉亲和素和亲和素分子形成非常强的键,这一特性可用于亲和纯化。由于生物素是小分子,因此不太可能影响蛋白功能4。
另一个有价值的标签是链球菌标签。其长度为 8 个氨基酸 (WRHPQFGG),因此也不太可能影响蛋白功能。而且它还能够可逆地和与生物素在相同的穴区结合。这意味着融合到链霉亲和素上的蛋白可以使用链霉亲和素树脂进行有效纯化,并能在温和的缓冲液中使用生物素进行洗脱5。
注意事项:
四聚体与单体亲和树脂:对于生物素标记的蛋白,可以用亲和素包被的色谱柱进行纯化,该色谱柱有四聚体形式和单体形式。四聚体亲和素色谱柱的洗脱过程需要强效变性剂,如尿素或盐酸胍,而单体树脂可以使用 10 mM 生物素缓冲液进行较温和的洗脱。
在哺乳动物系统中的使用:哺乳动物系统包含至少 4 种生物素化蛋白,可与您的目标蛋白共洗脱。但是,在大肠杆菌系统中很少遇到非特异性结合。