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细胞凋亡概述

了解多细胞生物的重要细胞死亡调控机制 — 细胞凋亡


细胞凋亡(apoptosis)具有多种生化特征,包括细胞皱缩、质膜起泡、染色体浓缩(固缩)、细胞核碎裂(核碎裂)、形成 DNA 条带以及细胞最终被吞噬体吞入。相较于细胞坏死,凋亡细胞不会引发炎症反应,并且体内细胞凋亡仅作用于单个细胞。

凋亡和坏死代表了细胞死亡的两个极端,此外还存在其他变异形式。例如,坏死性凋亡或自噬,它们具有与细胞坏死和细胞凋亡相通的一些特性。细胞死亡的途径很多,因此研究人员需要认真观察其形态学和生化特征,在谨慎选择的时间节点检测多个生化标记物,确定具体实验体系内的细胞死亡机制。

细胞凋亡机制


​半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族的半胱天冬酶(caspase)在细胞凋亡过程中,通过抑制 400 余种蛋白质的水解反应来加速细胞死亡。启动细胞死亡的方式主要有两种:内在细胞死亡途径和外在细胞死亡途径,两种途径皆由半胱天冬酶起始。

内在细胞死亡途径由 Bcl-2 蛋白家族控制,其通过线粒体调控细胞死亡。大量细胞内死亡信号的传递均通过内在细胞死亡途径实现,例如,DNA 损伤、致癌基因激活、生长因子缺乏、ER 应激以及微管破坏等。内在细胞死亡途径的关键环节是线粒体外膜透化,现已确认该过程不可逆,之后细胞将必定进入细胞死亡程序。透化后,线粒体内膜空间将释放各种蛋白质,从而促进半胱天冬酶活化和细胞凋亡。细胞色素 C 与 APAF-1(凋亡蛋白酶激活因子 1,包括 APAF-1 寡聚物)结合形成名为凋亡体的结构,该结构可招募并活化启动型半胱天冬酶 — 半胱天冬酶 9。半胱天冬酶 9 裂解并活化执行半胱天冬酶(半胱天冬酶 3 和 7),从而引发凋亡。

外在细胞死亡途径由细胞表面的“死亡受体”与其对应的配体(例如 Fas、TNFR1 或 TRAIL)结合来激活。上述死亡受体具有两个不同的信号模体(死亡结构域 (DD) 和死亡效应结构域 (DED)),死亡受体以此招募 Fas-相关死亡结构域蛋白 (FADD) 和半胱天冬酶 8 等其他衔接分子并与其发生反应,随后上述分子直接裂解并活化执行半胱天冬酶(半胱天冬酶 3 和半胱天冬酶 7),从而引发细胞凋亡。

外在细胞死亡途径由细胞表面的“死亡受体”与其对应的配体(例如 Fas、TNFR1 或 TRAIL)结合来激活。上述死亡受体具有两个不同的信号模体(死亡结构域 (DD) 和死亡效应结构域 (DED)),死亡受体以此招募 Fas-相关死亡结构域蛋白 (FADD) 和半胱天冬酶 8 等其他衔接分子并与其发生反应,随后上述分子直接裂解并活化执行半胱天冬酶(半胱天冬酶 3 和半胱天冬酶 7),从而引发细胞凋亡。

外在细胞死亡途径和内在细胞死亡途径在半胱天冬酶 8 裂解以及仅含 BH3 结构域蛋白 BID(BH3 结构域凋亡诱导蛋白)激活时进行交联,BID 的产物(截短型 BID,称 tBID)是有些类型细胞进行死亡受体诱导凋亡所必需的。

凋亡参数

凋亡的发生是通过复杂的信号级联实现的,该过程受多个节点的严密调控,因此存在许多评估相关蛋白的机会。下图所示为主要凋亡参数及其可被检出的相对时间。



Cell death parameters

​​

上述参数并非按照发生顺序排列,并且其中许多参数会重叠出现或同时出现。膜不对称性的消失和半胱天冬酶级联反应启动是凋亡的生化特征,但未必会导致细胞死亡。但一般将其他下游特征,例如线粒体跨膜电位 (ΔΨm) 降低、以及随后的细胞色素 C 释放至细胞质等被视为是不可逆的,此后的细胞极有可能无法存活。

上述凋亡相关的一些生化和形态学特征也可见于其他类型的细胞死亡,例如细胞坏死或坏死性凋亡。因此,建议通过分析多项参数确定细胞凋亡是否为所研究细胞群的死亡原因。

下表所示为细胞凋亡相关的主要参数及其最常用的研究方法。


细胞凋亡参数

检测方法

样品类型

膜不对称性的消失/PS 外翻

流式细胞法分析膜联蛋白 V 结合

活细胞

抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白的裂解

蛋白质印迹法评估蛋白质裂解

细胞提取物

组织提取物







半胱天冬酶活化

基于微量滴定板分析比色/荧光底物

细胞提取物

组织提取物

采用流式细胞术/镜检或通过微量滴定板分析检测荧光底物的裂解

活细胞

蛋白质印记法分析半胱天冬酶原和活化的半胱天冬酶

细胞提取物         

组织提取物

流式细胞术/镜检分析,使用能够特异性识别活化形式半胱天冬酶的抗体

活细胞(流式细胞术)                 

固定细胞(镜检)

微孔板分光光度分析,使用能够特异性识别活化形式半胱天冬酶的抗体

细胞提取物

组织提取物



半胱天冬酶底物 (PARP) 裂解

微孔板分光光度分析,使用裂解 PARP 的特异性抗体

细胞提取物

组织提取物

活细胞 (In cell ELISA)

蛋白质印记法分析裂解 PARP

细胞提取物

组织提取物

非半胱天冬酶的蛋白酶(钙蛋白酶和组织蛋白酶)活化

基于微量滴定板分析比色/荧光底物

细胞提取物

组织提取物


线粒体跨膜电位 (Δ​ψm) 降低

流式细胞术/镜检/微孔板分光光度分析,使用 Δ​ψm 敏感探针

活细胞

耗氧测定

活细胞



细胞色素 C 释放

蛋白质印记法分析细胞质中是否存在细胞色素分 C

固定细胞

通过抗体镜检细胞质中是否存在细胞色素分 C

固定细胞

亚 G1 细胞群增加

流式细胞法分析亚 G1 峰

固定细胞


核固缩

流式细胞法分析染色质固缩

活细胞

镜检分析染色质固缩

活细胞


DNA 片段化

琼脂糖凝胶法分析 DNA 条带

DNA

通过 TUNEL 分析 DNA 片段化

活细胞


质膜起泡

用光学显微镜观察质膜起泡

活细胞

蛋白质印记法分析裂解底物(凝溶胶蛋白,ROCK1)

细胞提取物

组织提取物




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