如何使用配对抗体对试剂盒进行夹心法 ELISA

关于如何使用我们的配对抗体对试剂盒进行夹心法 ELISA 的详细方案。

​​配对抗体对试剂盒包括捕获抗体和生物素标记的检测抗体对及经过校准的蛋白标准品。试剂盒采用标准夹心法 ELISA,有两种规格可选,分别适用于 2  或 10 x 96 孔板。

若测定需要额外的缓冲液和孔板,可购买配件包(ab210905),其中包括进行 10 x 96 孔板夹心法 ELISA 所需的所有试剂。

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方案概要

  1. 加入包被缓冲液稀释好的捕获抗体。
  2. 孵育,然后清洗。

  3. 用封闭缓冲液孵育,然后清洗,以阻断蛋白的非特异性结合。

  4. 在微孔板中加入标准品、对照品和样本,需做复孔。

  5. 孵育微孔板,然后清洗。

  6. 加入检测抗体。孵育,然后清洗。

  7. 加入 HRP 链霉亲和素溶液进行检测。孵育,然后清洗。

  8. 加入 TMB 底物检测。

  9. 加入终止液。

  10. 酶标仪读数,终点法用波长450 nm测定,动态读数用波长600 nm测定。


推荐的试剂和耗材

配对抗体对试剂盒 ELISA 配件包(10 x 96 孔板)(ab210905):含 Nunc MaxiSorp 96 孔微孔板、封板膜、包被缓冲液、10X 清洗缓冲液、10X 封闭缓冲液、TMB 和终止液;

Nunc MaxiSorp96 孔板 (ab210903);

包被缓冲液 1X (ab210899),35 mM NaHCO3,15 mM Na2CO3,pH 9.6,不含 NaOH;

封闭缓冲液 10X (ab210904),10X 封闭缓冲液可能含有沉淀物,使用前涡旋混匀。可将溶液调至室温,以增加溶解度。沉淀物对性能无不良影响。用 PBS 稀释至1X:1% BSA*,0.05% Tween® 20,溶于 1X PBS,pH 7.2-7.4;

* 我们建议使用纯度 ≥ 96% 的 BSA,因为纯度低的 BSA 会增加背景。

清洗缓冲液 10X (ab206977),用水稀释至1X;0.05% Tween® 20 的 1X PBS 溶液;

TMB 底物 (ab210902);

终止液 (ab210900):4.9% 正磷酸;

10X 磷酸盐缓冲液 (PBS) (ab128983),用水稀释至1X:0.14 M NaCl、0.003 M KCl、0.002 M KH2PO4、0.01 M Na2HPO4

链霉亲和素-HRP 溶液 (ab210901),50 μg/mL,建议用1X封闭缓冲液稀释至0.01-0.05 μg/mL;

标准品稀释用微量离心管;

双蒸水 (ddH2O);

可选:蛋白酶抑制剂混合物 (ab65621);

可选:BCA 蛋白定量试剂盒 (ab102536)。

注:NuncMaxiSorp 是 Thermo Fisher Scientific 拥有的未注册商标。

TWEEN® 是 Croda International PLC 的注册商标。

PROCLIN® 是 The Dow Chemical Company 或 Dow 关联公司的注册商标。


详细方案

  1. 向96 孔高结合微孔板(我们推荐 Nunc™ Maxisorp™ 96 孔板 (ab210903))的每个孔中加入 50 µL 2 µg/mL 捕获抗体。

  2. 用封板膜密封板。在 4℃ 下孵育微孔板过夜,或在室温下于微孔板摇床或振荡器上孵育微孔板 2 小时。

  3. 用350 µL 推荐的 1X 清洗缓冲液 (ab206977) 清洗孔板三次。在吸水纸上用力拍打微孔板,清除最后一次清洗液。

  4. 向各微孔中加入 300 μL 1X 封闭缓冲液 (ab210904),降低非特异性结合,密封微孔板,并在 4℃ 下孵育过夜或在室温下孵育 2 小时。

  5. 重复步骤 2 中的清洗程序。

  6. 微孔板可在封闭后立即使用,也可用免疫分析 1X 封闭缓冲液 (ab171534) 稳定,并在 4℃ 下储存。

  7. 临用前用连续稀释法制备标准品。制备足量标准品溶液,各浓度需做复孔。

  8. 加入 100 µL ddH2O 水复溶蛋白标准品。室温下轻轻混匀 10 分钟,确保蛋白完全溶解。此为标准品贮备液。未使用的复溶蛋白标准品应分装,并在 -80℃ 下保存。

    注:请参阅小瓶标签,了解蛋白标准品的数量。

  9. 标记 8 个试管,标准品编号为 1 至 8。

  10. 为制备标准品 1,用 1X 封闭缓冲液将标准品贮备液稀释至产品说明书中最高的浓度。建议用 1X 封闭缓冲液做2 倍连续稀释,标准曲线共含7个浓度。

  11. 标准品 8 为空白对照(仅缓冲液),不含蛋白标准品

  12. 用 1X 封闭缓冲液稀释实验样品。稀释后样品浓度处于检测范围内。如果目标蛋白浓度未知,建议使用 1 : 2 稀释倍数进行多次样品稀释。

  13. 向每个孔中加入 50 μL 稀释标准品和样品。密封微孔板,室温下在设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上孵育 2 小时。

  14. 用 350 μL 1X 清洗缓冲液 (ab206977) 清洗微孔板 3 次。在吸水纸上用力拍打微孔板,清除最后一次清洗液。

  15. 用 1X 封闭缓冲液 (ab210904) 或其他适当稀释液将检测抗体从贮备浓度0.25 mg/mL 稀释至建议的工作浓度0.5 μg/mL。请参阅标签,了解提供的检测抗体的数量。

    注:如欲获得最佳结果,可能需要优化工作液中检测抗体的浓度。详见 ELISA 疑难解析提示。

  16. 向每个孔中加入 50 μL 稀释的检测抗体。密封微孔板,室温下在设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上温育 1 小时。

  17. 重复步骤 14 中所述的清洗步骤。

  18. 向每个孔中加入 50 μL 用 1X 封闭缓冲液稀释后的 HRP-链霉亲和素溶液 (ab210901)。密封微孔板,室温下在设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上温育 1 小时。

  19. 重复步骤 14 中所述的清洗步骤。

  20. 向每个孔中加入 100 μL TMB 底物,并在设定为 400 rpm 的振荡器上避光孵育不超过20分钟

    注:如欲获得最佳结果,孵育时间需要优化。

  21. 向每个孔加入 100 μL 终止液。在孔板振荡器上振荡孔板 1 分钟,混匀。可在 400 nm 处动态读取孔板读数,以监测适当的孵育时间。

    详见 ELISA 疑难解析提示。

  22. 在 450 nm 处读板。

  23. 如下所述分析数据。


分析数据

​​计算空白对照(零)标准品的平均吸光度值。用所有其他吸光度值减去空白对照标准品吸光度平均值。

绘制各标准品已扣除平均空白对照的吸光度值(y 轴)与标准品已知蛋白浓度(x 轴)的关系图,创建标准曲线。使用绘图软件拟合贯穿这些点的最佳曲线,作为标准曲线。注:大多数酶标仪软件或绘图软件可以通过数值做出标准曲线。通常来说,四参数曲线拟合 (4 pL) 是最佳选择;但其他算法(例如线性、半对数、对数/对数、5-参数逻辑)也可以用来拟合更好的标准曲线。

有关计算 ELISA 原始数据的更多信息,请参见我们的网络研讨会

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