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免疫组化(IHC)实验通常包含一个或多个封闭步骤,以降低背景信号并减少假阳性。
其中包括
用血清或蛋白封闭液进行封闭可防止抗体与组织或 Fc 受体发生非特异性结合。理论上,任何不与靶抗原结合的蛋白质都可以用于封闭。但实际上,一些蛋白质更容易与非特异性位点结合。
血清是一种常见的阻断剂,因为它含有可与非特异性位点结合的抗体。推荐使用与二抗种属相匹配的血清。当使用来自不同种属的二抗进行多重染色时,可能需要使用来自两种二抗种属的封闭血清。
查看我们的正常山羊血清、正常驴血清或 IHC 封闭血清的完整列表。
蛋白质(如 BSA 或酪蛋白)也可用于阻断非特异性抗体结合,并且该类封闭液不需要与二抗的种属相匹配。
特制的封闭缓冲液也常用于阻断非特异性抗体结合。制备此类封闭缓冲液通常是为了优化性能和/或保质期。
查看蛋白封闭缓冲液。
用小鼠一抗染色小鼠组织时,由于抗小鼠二抗与内源性小鼠 IgG 和 Fc 受体结合,因此通常具有高背景。如本方案中所述,使用 F(ab)片段可以减少该背景结合。仔细匹配阻断片段和所用二抗往往很重要。
如果使用基于生物素的检测系统,建议对内源性生物素进行封闭。生物素存在于许多组织中,特别是在肾、肝和脑组织中。生物素的封闭通过用抗生物素蛋白预孵育组织的方式进行,然后预孵育的组织与生物素一起孵育以封闭抗生物素蛋白分子上的其它生物素结合位点。
查看生物素封闭液。或者,使用基于聚合物的检测系统时,不需要进行生物素封闭。
显色检测法通常使用直接或间接与二抗连接的酶来显现抗体定位。如果酶天然存在于所研究的组织中,则必须在检测步骤之前阻断其活性。
过氧化物酶封闭
使用 HRP 进行检测时,内源性过氧化物酶活性可能会导致非特异性或高背景染色。诸如肾脏、肝脏和含有红细胞的组织(例如维管组织)含有内源性过氧化物酶。为了检查内源性过氧化物酶活性,可以在一抗孵育前将组织与 DAB 底物一起孵育。如果组织变成棕色,则存在内源性过氧化物酶,需要进行封闭步骤。通常情况下,在 0.3% 过氧化氢中孵育 10-15 分钟即可实现封闭。
碱性磷酸酶封闭
内源性碱性磷酸酶(AP)在检测时可产生高背景。它存在于肾脏、肠道、成骨细胞、淋巴组织和胎盘中。冰冻组织中的 AP 活性较高。可以通过与 BCIP/NBT 一起孵育来检测组织中的内源性 AP;如果观察到蓝色,则存在内源性 AP,并且需要进行封闭。左旋咪唑可用于封闭,并与显色底物一并加入。加入一抗前,用弱酸(例如 1% 乙酸)封闭肠 AP。
使用荧光标记进行检测时,组织可能自发荧光,导致高背景。组织固定可以诱导自发荧光,特别是在使用醛固定剂(例如福尔马林)时,因为该固定剂会与胺反应,产生荧光产物。
自体荧光也可能是由于存在荧光化合物(如黄素和卟啉)引起的。这些化合物可以通过用于产生固定脱水切片的溶剂从组织中提取。但是,使用含水试剂处理过的冷冻切片中仍然会存在这些化合物。
为了减少自发荧光,可以使用非醛类固定剂,如 Carnoy 溶液,或者通过用硼氢化钠或甘氨酸/赖氨酸处理的方式来阻断醛。或者,尝试使用冷冻组织切片,或用淬灭染料(如脑桥胺天蓝色、苏丹黑、台盼蓝或 FITC 封闭液)处理组织,
如果不能阻断内源性自发荧光,则优先选择显色检测系统。
查看用于减少自发荧光的 FITC 蛋白质封闭液。