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一抗和二抗不匹配
二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白
使用高浓度抗体，延长 4℃ 孵育时间（如过夜）。
封闭剂和一抗或二抗有交叉反应
使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。
一抗不识别测试物种中的蛋白
参照说明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照。
抗原量不足
每泳道蛋白上样量不低于 20-30 μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
组织中目的蛋白含量低
浓缩使信号最大化（例如检测核蛋白要用核裂解物）。
转膜不充分
使用可逆染色剂例如丽春红 S 检测转膜效果,检查转膜操作是否正确。PVDF 膜需预先浸在甲醇中，然后浸到转移缓冲液中。
洗膜过度
勿过度洗膜。
一抗失效
使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。
二抗受叠氮钠抑制
避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。
检测试剂盒过期和底物失活
使用新鲜的底物。
未进行非特异性封闭或封闭不充分
延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。
一抗浓度过高
稀释抗体至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好）。
孵育温度过高
4 ℃ 下孵育。
二抗与封闭剂非特异性结合或反应
设置二抗对照(不加一抗)。
一抗或二抗与封闭剂有交叉反应
在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗
体而易产生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。
未结合蛋白质洗涤不充分
增加洗涤次数。
膜的选择导致的高背景
NC 膜比 PVDF 膜背景低。
膜干燥。
在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液，放入搅拌子不断搅动或轻轻振荡使膜浸在溶液中，避免出现干
膜现象。
细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同
使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。
体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等
查阅文献，使用试剂使样品去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰。
蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）
在样品缓冲液中加入足够的蛋白酶抑制剂。
检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白
查阅其它文献报道，或 BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。
一抗浓度过高，高浓度时常出现多条蛋白带
降低抗体浓度和/或孵育时间。
抗体未经纯化
使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带。
条带为非特异性条带
应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。
靶蛋白形成多聚体
SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白质解聚。
转膜过程中尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动。
抗体结合了封闭剂。
过滤封闭剂。
一抗或二抗加入过多
稀释抗体的浓度。
抗体和分子量蛋白标准发生了反应
在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。
分离不彻底。
改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。
迁移速度过快。
降低电泳电压。
电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度）
降低迁移速度或低温电泳(冷库或冰上)。
制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀
参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。
细菌污染
4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。
抗体量不足
确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。