WB 实验步骤关键点合集
abcam 整理了 WB 实验中不容忽视的小细节，并将精华内容制作成了 WB 实验check list，方便您对照这张表来检查每个实验步骤的关键点。您可以点击图片下载 Checklist。
WB 实验流程通常包括样本制备、电泳、转膜、封闭、抗体孵育和检测 6 个部分。这 6 个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。
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样本选择和处理
蛋白分子参与生命活动的各个过程，其功能复杂多样，有些蛋白可能只在部分组织和细胞表达（图1）。有些蛋白可能需要诱导，才能表达或表达量增加（图2）。有些蛋白可能存在翻译后修饰，导致其蛋白分子量大小可能与预测不符（图2，3）。有些蛋白可能有多个异构体或者容易被降解，导致出现多条条带的现象（图2）。因此，只有足够了解您研究的蛋白特性，您才能在样本的选择和处理上得心应手，美美的开启您的 WB 之旅。
图2 在HeLa细胞中HIF-1 alpha蛋白需低氧诱导才表达。 Lane 1 : 未处理C6 (rat glial tumor glial cell)全细胞裂解液； 预测分子量: 92 kDa；检测到分子量: 110 kDa。 |
图3 SQSTM1 / p62蛋白。 Lane 1:人肝脏裂解液； 预测分子量: 47 kDa；检测到分子量: 62 kDa。 |
样本制备
样本制备是 WB 实验的开端，裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本制备是否成功。
以下是一些样本制备过程中需关注的小细节：
- 添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。如果涉及蛋白修饰的检测，需添加相应的去修饰酶抑制剂，例如对于磷酸化修饰蛋白添加复合磷酸酶抑制剂，以防止蛋白在提取时被去磷酸化。
- 选择合适的裂解液来富集更多靶标蛋白。
- 超声破碎处理细胞以富集更多靶标蛋白。
超声处理富集THP-1细胞中的Histone H3蛋白。 Lane 1:超声处理THP1全细胞裂解液； Lane 2:未处理THP-1全细胞裂解液。 |
- 整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。
- 一般来说，蛋 95℃变性5-10min。对于有些多次跨膜蛋白，37℃或者70℃ 10min可能效果更好。
- 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本蛋白浓度。
电泳
电泳可以将靶标蛋白与其它蛋白分开，更易检测。不同浓度的分离胶对不同分子量的的蛋白分离效果是不同的。蛋白的上样量，也会影响是否可以检测到有效信号或者获得漂亮的图片。设置阳性和阴性对照不仅有助于分析蛋白功能，在WB实验失败时也有助于分析失败的原因。
在电泳时需要特别关注以下小细节：
- 根据蛋白大小选择合适的电泳胶浓度，以确保不同蛋白的迁移速率与分离程度最优。具体可参考表1。
- 表1 不同浓度的分离胶选择
蛋白的分子量大小 | 分离凝胶丙烯酰胺百分比 |
4–40 kDa | 20% |
12–45 kDa | 15% |
10–70 kDa | 12.5% |
15–100 kDa | 10% |
25–200 kDa | 8% |
- 对于分子量较小的靶标蛋白(如分子量<25 kDa），请使用较高浓度的分离胶进行电泳。
- 对于分子量较大的靶标蛋白（如分子量>100 kDa），请使用较低浓度的分离胶进行电泳。
- 至少上样20μg总蛋白进行电泳。
- 建议使用阳性和阴性对照。
转膜
转膜是指将蛋白从电泳胶上转移到膜上，方便目标蛋白的检测。转膜缓冲液中SDS和甲醇含量对不同分子量蛋白的转膜影响是不同的。PVDF膜孔径的选择依赖于蛋白分子量大小。转膜结束后，丽春红染色使蛋白可视化，方便判断转膜是否成功。
甲醇浓度对转膜效率的影响。HeLa全细胞裂解液中DNA PKcs蛋白检测。 Lane 1: 转膜缓冲液中甲醇浓度10%； Lane 2: 转膜缓冲液中甲醇浓度20%。 |
丽春红染色判断转膜是否成功。左图：转膜成功；右图：转膜失败。 |
在转膜时需要特别关注以下小细节：
- 对于分子量较大的靶标蛋白，建议在转膜缓冲液中加入SDS至终浓度为0.1%。
- 对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用0.45μm的PVDF膜。
- 对于分子量较小的靶标蛋白，建议使用0.22μm的PVDF膜。
- 对于分子量较大的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。
- 对于分子量较小的靶标蛋白，建议转膜缓冲液中使用20%甲醇。
- PVDF膜激活完成后充分清洗，完全去除膜上残留甲醇。
- 转膜开始前请确认胶与膜之间没有任何气泡。
- 建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功（如果选择荧光标记检测，请确保丽春红完全清洗干净）。
封闭
封闭是使未有蛋白吸附的区域被封闭，以防止抗体的非特异性结合，从而降低背景，提高检测灵敏度。常用的封闭液有5%脱脂奶粉和5% BSA或特定封闭液。
在封闭时需要特别关注以下小细节：
- 没有适用于所有体系的封闭液，请选择合适的封闭液。