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Nrf2是一个对于氧化应激反应非常重要的转录因子,它会结合在位于许多细胞保护基因启动子区域的抗氧化反应元件(ARE)上。
在正常情况下,Nrf2会被BCR(KEAP1)复合体泛素化修饰并在细胞质中降解。
在氧化应激反应中,亲电子代谢物会抑制BCR(KEAP1)复合体活性,促进NFE2L2/NRF2与一类小的Maf蛋白形成异二聚体,在细胞核内发生聚集现象。
Nrf2也会通过调节β-珠蛋白增强子活性参与β-珠蛋白簇基因的转录激活。
广谱表达
成年肌肉、肾脏、肺、肝组织和新生胎儿肌肉组织中高表达。
在正常情况下,Nrf2定位于胞质。
在氧化应激反应,亲电试剂,化学激活剂刺激下,Nrf2在细胞核中聚集 。
图二:Nrf2 ICC实验结果图,Anti-Nrf2 antibody [EP1808Y] - ChIP Grade (ab62352)。绿色:Nrf2,红色:Tubulin,蓝色:DAPI。 |
人(Q16236):异构体1-3 :65-68 kDa (预测)
小鼠(Q60795):67kDa(预测)
大鼠(O54968):异构体1-2 :67-68 kDa (预测)
Nrf2具有乙酰化,糖基化,磷酸化,泛素化修饰
在正常情况下,Nrf2会被泛素化修饰并在细胞质中降解导致在WB中难以检测,加入MG132能有效抑制该降解过程,增加Nrf2的检测信号。
氧化应激反应,亲电试剂,化学激活剂和自噬会导致NFE2L2/NRF2在细胞核内聚集,所以适当的样本刺激处理对于WB 实验的成功至关重要。
Nrf2预测分子量68 kDa,但由于存在异构体及翻译后修饰,WB实验中可能观察到多条条带的情况,同时,实际检测到的分子量大于100 kDa,与预测分子量存在区别,建议不要裁膜。
2 µM MG-132处理18小时的Hela或HepG2全细胞裂解液
25 µM MG-132处理4小时的HCT 116全细胞裂解液
30 µM tBHQ处理4小时的MDA-MB-231细胞核裂解液
人源重组Nrf2蛋白(ab132356)
未经刺激处理的正常Hela、HCT 116、HepG2等全细胞裂解液
图三:WB-Anti-Nrf2 antibody [EP1808Y] - ChIP Grade (ab62352)。一抗:使用ab62352,浓度1/200。封闭:使用5%脱脂牛奶。泳道1:未经处理的HCT 116全细胞裂解液泳道2:25 µM MG-132处理4小时的HCT 116全细胞裂解液二抗:使用ab97051,浓度1/20000。预测条带大小:68 kDa检测条带大小:100 kDa |
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点: 样本制备 添加足够量的蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。 超声破碎处理细胞以富集靶标蛋白。 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。 电泳 至少上样 20μg 总蛋白进行电泳。 转膜 强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。 抗体孵育 强烈建议在进行WB实验时使用新鲜抗体,避免重复使用。 |