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Ki67对于细胞在有丝分裂时维持染色体分散于细胞质中很重要。
Ki67直标研究和病理中被广泛用作肿瘤标志物。
对多种癌症的预后和诊断价值。
Ki67指数与肿瘤疾病的病程相关,可用于评估患者生存和癌症进展。
与增殖细胞的数量有关,而与增殖速率无关。
在心脏,大脑,骨骼肌和睾丸中含量最高。
在肝脏中观察到很少的表达。
细胞分裂间期,在核仁周围的纤维蛋白缺陷区形成纤维样结构。
细胞核
图二:Ki67蛋白的ICC实验结果图,Anti-Ki67抗体(ab16667)。绿色:Ki67,红色:alpha Tubulin,蓝色:DAPI。 |
人(P46013):长异构体: 358.7 kDa (预测)
短异构体 : 319.4 kDa (预测)
小鼠(E9PVX6):异构体1: 350.9 kDa (预测)
异构体2: 324.7 kDa (预测)
大鼠(D4A0Y6): 343.4 kDa (预测)
有丝分裂时磷酸化或者高度磷酸化。
高磷酸化形式不能与DNA结合。
Ki67主要在增殖细胞中表达,在部分正常组织中几乎不表达(eg:肝脏),所以,在具有较强增殖能力的肿瘤组织中比较容易检测到Ki67,可尝试使用HE染色区分肿瘤/瘤旁组织,进而确保样品中含有增殖分裂旺盛的组织,因此选择正确的样本有助于拿到更好的实验结果。
虽然在增殖细胞中可以检测到Ki67,但部分组织中的增殖细胞含量较少(eg:结肠基底部),最终切片中可能会观察到阳性细胞比例较低或无信号的现象,建议尝试更换切片找到较为合适的观察视野。
若不确定自己的样本是否表达靶标蛋白,强烈建议在实验中使用阳性对照,比如扁桃体组织的生发中心。
人扁桃体组织。
大鼠和小鼠脾脏组织。
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点: 样本固定 样本固定时间取决于组织块大小与组织类型,但对于大多数样本,室温固定18-24小时较为合适。 固定不足会导致组织切片因边缘染色而信号强,中间未染上而无信号。 抗原修复 抗原修复条件需要优化,对石蜡切片进行免疫组化实验时,可以尝试在高压锅中对玻片进行110℃修复15min。 对冰冻切片进行免疫组化实验时,如果使用4% PFA固定较长时间样本 (例如18-24小时),建议使用酶抗原修复或微波修复方法。 封闭 如后续使用HRP结合物进行检测,请使用3%过氧化氢处理切片10分钟以封闭内源性过氧化物酶。 如使用荧光基团偶联的二抗进行实验,请提前在封闭过程中使用0.3M glycine淬灭醛基引起的自发荧光。 |
Ki67定位在染色体和细胞核,因此推荐使用4% PFA固定细胞。不合适的固定剂可能会导致无染色现象。
细胞状态会影响蛋白正常定位,因此固定细胞前需确保待测细胞处于正常状态,不正常状态的细胞可能会引起待检蛋白不正确定位。
HeLa细胞。
HAP1细胞。
图四:ICC- Anti-Ki67抗体(ab16667)。绿色:Ki67,红色:alpha Tubulin,蓝色:DAPI。样品名称:HeLa细胞。A: 4% PFA Hela 细胞10分钟,然后0.1% Triton X-100通透处理5分钟。B: 4% PFA Hela 细胞10分钟 |
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点: 样本准备 确保待检细胞处于正常状态。通常培养细胞密度在60%-80%左右比较合适。 样本固定 使用4%PFA对Ki67进行固定,推荐室温固定10-20分钟。 样本通透 推荐使用0.1-0.25% Triton-X 100室温通透10分钟。 |