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催化产生一氧化氮(NO),一氧化氮是一种信使分子,在全身有不同的功能。
在巨噬细胞中,NO有杀伤肿瘤和细菌的作用。iNOS也具有亚硝基化酶活性,并介导COX2等细胞质靶蛋白的半胱氨酸S-亚硝基化。
内毒素、细胞因子、IFNG/ IFN-γ能与细菌脂多糖(LPS)、TNF或IL1B/白细胞介素-1 β协同作用诱导iNOS的表达。
在肝脏、视网膜、骨细胞和肺的气道上皮细胞中表达。
在血小板中不表达。
细胞质
图二:iNOS的ICC实验结果图,Anti-iNOS [RM1017]产品(ab283655)。绿色:iNOS,红色:alpha Tubulin,蓝色:DAPI。 |
人(P35228):异构体1、2:126-131 kDa(预测)
小鼠(P29477):131 kDa(预测)
大鼠(Q06518):131 kDa(预测)
多聚泛素化和磷酸化
iNOS只在部分组织和细胞中表达,所以设置阳性对照非常重要。
在细胞因子和其他因子(如0.1 µg/mL LPS处理 RAW 264.7 细胞6小时)的作用下诱导iNOS表达。
Caco-2全细胞裂解液
100ng/ml LPS处理6h的RAW 264.7全细胞裂解液
RAW 264.7全细胞裂解液
C6全细胞裂解液
图三:Anti-iNOS [RM1017]产品(ab283655)。一抗:使用Anti-iNOS一抗,浓度1/1000稀释。封闭:使用5% NFDM/TBST封闭液。泳道1:Caco-2全细胞裂解液;泳道2:RAW 264.7全细胞裂解液;泳道3:100ng/ml LPS处理6h的RAW 264.7全细胞裂解液;泳道4:C6全细胞裂解液;泳道5:100ng/ml LPS处理4h的C6全细胞裂解液;二抗:使用Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase conjugated (ab97051)二抗,浓度1/100000稀释。预测条带大小:131 kDa |
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点: 样本制备 使用复合蛋白酶抑制剂防止靶标蛋白被降解。 整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。 设置阳性和阴性对照。 电泳 至少上样20μg总蛋白进行电泳。 推荐使用8%或更低浓度的分离胶。 转膜 强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。 推荐在转膜缓冲液中增加终浓度为0.1%的SDS。 推荐使用0.45μm PVDF膜。 推荐转膜缓冲液中甲醇浓度为10%。 |