IHC 实验步骤关键点合集
abcam 整理了 IHC 实验中不容忽视的小细节，并将精华内容制作成了 IHC 实验check list，方便您对照这张表来检查每个实验步骤的关键点。您可以点击图片下载 Checklist。
IHC 实验流程通常包括样本固定、包埋、切片、抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、酶底物显色或荧光检测、封片观察 9 个部分。这 9 个部分是环环相扣，每一步的疏忽都可能导致一无所获。
IHC 实验流程
样本固定
正确的固定是免疫组织化学方法的关键，免疫组化无法检测一个已经不存在的抗原。很多抗原在离体组织中只存在很短时间，自溶（autolysis）和坏死（necrosis）使得抗原进一步降解，组织形态和结构被破坏。样品浸泡在合适的固定液中，固定液完全渗透组织，使蛋白失去活性，并且使组织被「保存」、稳定在接近 in vivo 状态。
固定溶剂通常分为两种：
交联试剂——Crosslinking reagents (多聚甲醛，福尔马林等)
- 会在蛋白间形成交联，保护组织结构
- 降低抗原性，需要抗原修复
有机溶剂——Organic solvents （甲醇，乙醇，丙酮等）
- 有通透作用
- 不推荐用于膜蛋白的检测
样本固定是 IHC 实验最基础也是很关键的一步哦，请注意以下事项：
1. 样本固定时间取决于组织块大小与组织类型，但对于大多数样本，室温固定18-24小时较为合适。
2. 固定不充分会导致样本边缘信号较高而中心信号较弱，甚至无信号。
3. 过度固定则会封闭抗原表位，虽然抗原修复会暴露其中一部分表位，但如果组织固定时间非常长（如一周以上），则会发生抗原修复后依然无信号的现象。
样本包埋与切片
根据实验需要，选择合适的包埋剂对样本进行包埋，同时选择合适的切片机进行切片。
石蜡包埋组织 | 冰冻组织 | 漂片 | |
固定 | 包埋前：甲醛 | 切片前或切片后：甲醛、 甲醇、乙醇或丙酮 | 切片前： 甲醛 |
包埋/冷冻 | 组织脱水、透明化处理后，加入石蜡（预热到 60℃），放置过夜。 | 将组织浸没在液氮、异戊烷中冷冻或将样本埋入干冰中冰冻。 检测磷酸化等翻译后修饰时，常使用速冻方式。 | 不需要包埋 |
|
对于常见三种切片方法的优劣对比如下：
切片 | 切片机 | 冰冻切片机 | 振动切片机 |
储存 | 室温下储存多年。 | -80 ℃ 下储存 1 年 （-190℃下储存时间更 长）。 | 置于冷冻保护剂中，在 -20℃下储存，或者 4℃ 下在 PBS+叠氮化物中短期储存。 |
优势 | 容易操作，不会损坏切 片。 | 保留酶的功能和抗原性。 实验流程简短（通常不需要冗长的固定步骤）。 | 更厚的切片（> 25 µm）： 可以更好地分析组织的 3D 结构。 |
局限性 | 过度固定会掩盖抗原表 位，进而增加抗原修复的需求。 处理时间长：在梯度酒精和二甲苯中逐步脱水，以便于石蜡渗透。 | 如果没有快速冷冻组织， 可能会形成冰晶，从而破坏组织结构。 冰冻切片通常比石蜡切 片厚，可能会导致分辨率 低、图像差。 可能需要阻断内源活性酶。 | 难以对微小结构和单个 细胞的成像。 可能需要额外的组织透明化方法（如 CLARITY）， 以减少光散射并对较厚的切片进行成像。 |
抗原修复
福尔马林或多聚甲醛固定会导致蛋白交联(亚甲基桥)，从而掩盖抗原表位，限制抗原 - 抗体的结合。抗原修复则会破坏这些亚甲基桥，暴露抗原表位，允许其与抗体结合。
通常对于石蜡切片，抗原修复必不可少，而冰冻组织切片通常不够牢固 ，进行抗原修复时会损坏切片。一般会避免使用甲醛固定剂固定冷冻切片（或者在使用时大大减少固定时间），从而省去或减少抗原修复需求。
抗原修复通常有两种不同的方法：
- 酶抗原修复：胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等
- 热抗原修复：高压蒸汽法、微波法、水浴加热法等
酶抗原修复通常会破坏组织的完整性，在一定程度上影响抗原，且修复效率有限，通常适用于冰冻切片，但其操作标准化难度大：酶浓度、反应时间和温度均须根据自己的实验要求进行摸索和优化。
热抗原修复的参数则更可控，但微波炉加热可能会导致抗原修复不均匀，沸水剧烈沸腾可能会导致发生脱片，所以高压蒸汽法是更推荐大家使用的！
好的抗原修复取决于好的抗原修复方法和合适的抗原修复液，而抗原修复液取决于靶抗原所需的 pH 值，通常 pH 6.0 的柠檬酸钠修复液较为温和，而 pH 9.0 的 Tris-EDTA 修复液则更为剧烈。所以提醒大家初次进行 IHC 实验时可以根据产品说明书相应结果选择合适的抗原修复液。
封闭
对切片进行封闭，是为了阻断抗体抗原之间的非特异结合，降低背景和潜在假阳性染色。
切片封闭与否结果对比 |
温馨提醒：如果后续使用 DAB 等 HRP 标记物进行显色反应，那在封闭前一定要记得使用 3% 过氧化氢对内源性的过氧化物酶进行失活处理。
一抗孵育
免疫染色的成功依赖于靶标抗原特异性结合的一抗，确定最佳或最优的抗体工作浓度，可以使特异性染色最大化并减少背景。