ICC 实验步骤关键点合集
abcam 整理了 ICC 实验中不容忽视的小细节，并将精华内容制作成了 ICC 实验check list，方便您对照这张表来检查每个实验步骤的关键点。您可以点击图片下载 Checklist。
ICC 实验流程通常包括细胞培养与固定、通透处理、封闭、一抗孵育、二抗孵育和封片观察 6 个部分。
ICC 实验流程
细胞培养与固定
细胞培养是 ICC 实验的基础，细胞状态直接影响 ICC 实验结果。不管是悬浮细胞还是贴壁细胞，进行 ICC 实验时都需要确认以下注意事项：
- 细胞状态是否正常：形态，密度等
- 有些抗原需要药物或胁迫刺激才表达
- 细胞传代次数过多导致特征发生变化
- 细胞爬片是否使用如 Poly-lysine 等进行包被（coating）处理，使细胞更易于吸附在爬片上
细胞固定所使用的固定剂也分为交联试剂和有机溶剂两类，交联试剂有利于保护细胞结构，但是会产生蛋白交联，可能会降低抗原性；而预冷的有机溶剂固定会吸去脂类使细胞脱水、蛋白变性，通常不需要对细胞进行额外的通透处理。
- 对于细胞核抗原，可以尝试对细胞使用 4% PFA 室温固定 10-20min。
- 对于细胞浆抗原，可以尝试对细胞使用 -20℃ 预冷甲醇 -20℃ 固定 5-10min。
对于不同的靶标蛋白，选择合适的固定剂非常重要，如图，ITAM 是一个定位于细胞膜上的靶标蛋白，使用无水甲醇对细胞样本进行固定，则可以很好的观察到 ITAM 的表达，而使用 4% PFA 进行固定则会得到错误的定位结果。
不同固定剂对 ITAM 蛋白定位的检测 |
通透处理
通透即为对细胞膜进行打孔处理，使抗体能进入到细胞中和抗原发生结合。
细胞膜打孔处理示意图 |
通常，当抗体检测细胞内蛋白时（包括抗原表位在胞内段的跨膜蛋白），需要对细胞进行通透，一般将细胞样品在含 0.1-0.25% Triton X-100 的 PBS 中孵育 5-10 分钟。如使用有机溶剂固定则不需要额外进行通透处理。
封闭
对样本进行封闭，同样是为了阻断抗体抗原之间的非特异结合，降低背景和潜在假阳性染色。如使用荧光标记物进行后续实验, 当使用甲醛固定时，在封闭液中加入0.3M 甘氨酸，淬灭醛基引起的自发荧光，这样得到的结果更优质。
一抗孵育
同样，ICC 实验的成功也依赖于靶标抗原特异性结合的一抗，确定最佳或最优的抗体工作浓度，可以使特异性染色最大化并减少背景。
同时也建议在进行新的 ICC 实验时，使用新鲜抗体，避免重复利用。不熟悉抗体稀释度的小伙伴也可以根据相应产品说明书推荐的起始浓度进行尝试。
二抗孵育
对于绝大多数实验者来说，荧光二抗一定是他们的第一选择，所以对于带有荧光基团的二抗，提醒：
1. 一定要注意避光保存！
2. 确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生。
3. 多蛋白检测时，选择偶联不同荧光基团的二抗，避免串色现象发生。
常见经典荧光染料与配色 |
封片观察
显色完成后，通常会使用 DAPI 或其它核染料对细胞进行复染，以更好的指示细胞核结构。
复染完成后，在切片上滴加中性树脂或直接使用含 DAPI 的防荧光淬灭封片剂，在切片上盖上玻片来保护和保存切片。
封片剂的优点在于维持细胞样品状态，防止样品变干，同时可以防止荧光淬灭，提高折射率（Refractive Index），提高图像的分辨率，以获得高质量的 ICC 实验结果。