为了使您在Abcam官网的浏览体验更顺畅,请使用最新版本的浏览器比如 Google Chrome
Take a look at our BETA site and see what we’ve done so far.
Search and browse selected products
Purchase these through your usual distributor
图一:GFAP蛋白结构。图片来源:SWISS-MODEL。 |
GFAP是成熟星形胶质细胞中的主要中间丝蛋白,是一种细胞特异性标记物,其表达在大脑的特定区域内有所不同。
GFAP也是星形胶质细胞中细胞骨架的重要组成部分。
在中枢神经系统发育过程中,GFAP将星形胶质细胞与其他神经胶质细胞区分开。
脑疾病的特征是星形胶质细胞的活跃炎症状态,通常被描述为GFAP的上调。
GFAP在缺乏纤连蛋白的细胞中表达。
GFAP定位于细胞质,与中间丝相关。
图二:GFAP ICC实验结果图,Anti-GFAP antibody [EPR19996] (ab207165)。绿色:GFAP,红色:MAP2,蓝色:DAPI。 |
人(P14136):异构体 1-3: 50kD(预测)
小鼠(P03995):异构体 1-2: 49-50kD(预测)
大鼠(P47819):异构体 1-2: 49-50kD(预测)
PKN1对GFAP进行磷酸化修饰
GFAP作为星形胶质细胞的标志物,其在神经系统和大脑中富集表达,所以选择合适的脑区样本或裂解物进行WB实验非常重要。
WB结果可能出现位于48-50kDa的条带(预测条带为50kDa)。
人、小鼠和大鼠脑组织裂解液
人、小鼠和大鼠小脑组织裂解液
人源重组GFAP蛋白(ab114149)
鼠源重组GFAP蛋白(ab226309)
图三:WB- Anti-GFAP antibody [EPR1034Y] (ab68428)。一抗:使用ab68428,浓度1/10000。泳道1:小鼠小脑组织裂解液泳道2:小鼠脑组织裂解液预测条带大小:50 kDa检测条带大小:50 kDa |
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点: 样本制备 添加足够量的蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。 整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。 通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。 电泳 至少上样20μg总蛋白进行电泳。 进行新的WB实验时使用阳性裂解液作为对照。 转膜 强烈建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。 |
查看抗体产品说明书,确认抗体是否经过 IHC 验证,并确认验证的 IHC 类型(福尔马林/PFA 固定、冰冻切片等)。始终确保所用组织或细胞系来源于已测试的物种。
IHC-Fr实验若使用灌流固定的组织,切片后无需再固定;若使用异戊烷等速冻的新鲜组织,切片后需要用4℃预冷的PFA或甲醇固定10min。
使用醛类固定组织后,需要参考抗体产品说明书进行相应的抗原修复。(例如使用ab68428开展IHC-Fr实验,需使用pH=6.0的柠檬酸钠缓冲液进行20min热修复。)
每轮实验都要设置阳性对照和阴性对照,阳性对照确保一抗/二抗的有效性,阴性对照为不加一抗的二抗对照。
IHC-P: 人大脑组织
大鼠大脑组织
小鼠大脑组织
IHC-Fr:小鼠大脑组织
图一:GFAP蛋白的IHC实验结果图,GFAP antibody(EPR1034Y)抗体(ab68428)。样品名称:人小脑石蜡切片一抗:使用Anti-GFAP [EPR1034Y] (ab68428)一抗,稀释250倍抗原修复方法:高压锅加热,柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0) |
在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点: 样本固定 样本固定时间取决于组织块大小与组织类型,但对于大多数样本,例如使用4%PFA固定,室温固定18-24小时较为合适。 固定不充分会导致样本边缘信号较高而中心信号较弱,甚至无信号。 过度固定则会封闭抗原表位,虽然抗原修复会暴露其中一部分表位,但如果组织固定时间非常长(如一周以上),则会发生抗原修复后依然无信号的现象。 抗原修复 对石蜡切片进行免疫组化实验时,我们建议使用高压锅进行热诱导抗原修复。可以尝试110℃修复切片15分钟。修复后要自然冷却,避免放入冷水中,以免温度骤降引起脱片。 对于质地比较脆,在高温高压修复过程中易脱片的组织(如骨,软骨);或组织本身切面比较小,如坐骨神经,也可以选择微波修复。使用酶进行抗原修复,请对酶浓度及修复时间进行优化,避免损伤切片组织形态。 对冰冻切片进行免疫组化实验时,如前期样本经过醛类固定18-24小时,可以尝试使用微波炉进行短时修复或使用酶进行抗原修复,但请对酶浓度及修复时间进行优化,避免损伤切片组织形态。 封闭 如后续使用HRP结合物进行检测,请使用3%过氧化氢处理切片10分钟以封闭内源性过氧化物酶。 如使用荧光基团偶联的二抗进行实验,推荐使用添加1%的BSA和终浓度为0.3M glycine的封闭液,以淬灭醛基引起的自发荧光。 孵育一抗之前需要用血清封闭,并且避免选择宿主同种属的封闭液。血清来源可根据二抗host来选择,例如二抗为Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP polymer) 或Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP polymer),封闭液可选山羊血清。 注意一抗的宿主种属以及所检测样本的种属,例如宿主为mouse的一抗检测mouse组织,容易出现非特异染色,可以添加合适的IgG 封闭试剂来阻止与内源性IgG结合,从而减少非特异染色。 |