蛋白质印迹缓冲液和母液

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目录

• RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）
• Nonidet-P40 (NP-40) 缓冲液
• 细胞骨架结合蛋白提取缓冲液
• 可溶蛋白缓冲液
• 制备原钒酸钠
• TBS 10×（浓缩 Tris 缓冲盐溶液）
• TBS 10× 替代配方（浓缩 Tris 缓冲盐溶液）
• TBST（Tris 缓冲盐溶液，0.1% Tween 20）
• 中强膜再生液
• 高强膜再生液
• 细胞核分离实验方案试剂缓冲液 A
• 细胞核分离实验方案试剂缓冲液 B
• TBS 0.025% Triton X-100
• 1.6% H₂O₂（过氧化氢）的 TBS 溶液
• 一抗的 TBS 溶液（含 1% BSA）
• 生物素化二抗的 TBS 溶液（含 1% BSA）
• ABC（抗生物素-生物素复合物）的 TBS 溶液
• 碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)

​​RIPA 缓冲液

RIPA 缓冲液含有离子去垢剂脱氧胆酸钠作为活性成分，特别适用于破坏核膜提取细胞核内物质。RIPA 缓冲液产生的背景低，但可使激酶变性。它还能破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

50 mM Tris HCl，pH 8.0
150 mM NaCl
​1% NP-40
​0.5% 脱氧胆酸钠
​0.1% SDS

​10% 脱氧胆酸钠母液（5 g 脱氧胆酸钠溶于 50 mL 溶液中）避光保存。

NP-40 缓冲液

20 mM Tris HCl，pH 8.0
137 mM NaCl
10% 甘油
1% NP-40
2 mM EDTA

细胞骨架结合蛋白提取缓冲液

10 mM Tris，pH 7.4
100 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1 mM NaF
​20 mM Na₄P₂O₇
2 mM Na₃VO₄
1% Triton X-100
10% 甘油
0.1% SDS
0.5% 脱氧胆酸盐

可溶蛋白缓冲液

20 mM Tris-HCl，pH 7.5
1 mM EGTA（Ca²⁺​ 螯合剂）

制备原钒酸钠

所有流程必须在通风橱中进行。

1.       用双蒸水制备 100 mM 原钒酸钠溶液

2.       用 HCl 将 pH 调节至 9.0

3.       煮沸至无色

4.       冷却至室温

5.       再次将 pH 调节至 9.0

6.       再次煮沸至无色

7.       重复以上循环，直到煮沸并冷却溶液之后的 pH 保持 9.0

8.       用水补至初始体积

9.       分装之后保存于 -20 ℃

10.   如果样品变黄，丢弃样品

避免煮沸期间体积变化过大，可用盖子稍微盖住容器上方，减少蒸发。

TBS 10×（浓缩 Tris 缓冲盐溶液）

1 L 溶液：
24 g Tris 碱（式量：121.1 g）
88 g NaCl（式量：58.4 g）
溶于 900 mL 蒸馏水中
用 12 N HCl 将 pH 调节至 7.6
加入蒸馏水至终体积为 1 L

要制备 1× 溶液，将 1 份 10× 溶液与 9 份蒸馏水混合，并再次将 pH 调节至 7.6。1× 溶液的最终摩尔浓度为 20 mM Tris 和 150 mM NaCl。

Tris 缓冲液的替代配方同时含有 Tris 碱和 Tris-HCl。这可避免大量使用具有潜在危险性的盐酸来中和单独的 Tris 碱。

TBS 10× 替代配方（浓缩 Tris 缓冲盐溶液）

1 L 溶液：
24 g Tris-HCl（式量：157.6 g）
5.6 g Tris 碱（式量：121.1 g）
88 g NaCl（式量：58.4 g）
溶于 900 mL 蒸馏水中

1.       在室温下将溶液 pH 调节至约 7.6。如果溶液过碱，用浓 HCl 将 pH 调节至 7.6；如果溶液过酸，用浓 NaOH 将 pH 调节至 7.6。

2.       加入蒸馏水至终体积为 1 L。

3.       要制备 1× 溶液，将 1 份 10× 溶液与 9 份蒸馏水混合，并再次将 pH 调节至 7.6。

4.       1× 溶液的最终摩尔浓度为 20 mM Tris 和 150 mM NaCl。

TBST（Tris 缓冲盐溶液，0.1% Tween 20）

1 L 溶液：
100 mL TBS 10×
900 mL 蒸馏水
1 mL Tween 20

中强膜再生液

15 g 甘氨酸
1 g SDS
10 mL Tween 20

1.       用超纯水将体积调节至 800 mL。

2.       将 pH 调节至 2.2。

3.       加蒸馏水至 1 L。

高强膜再生液

需要在通风橱中进行。

100 mL 溶液：
20 mL SDS 10%
12.5 mL Tris HCl，pH 6.8，0.5 M
67.5 mL 蒸馏水
在通风橱中加入 0.8 mL β-巯基乙醇

细胞核分离实验方案试剂缓冲液 A

10 mM HEPES
​1.5 mM MgCl₂
10 mM KCl
0.5 DTT
​0.05% NP-40（或 0.05% Igepal 或 Tergitol），pH 7.9

要制备 250 mL 缓冲液 A 的母液：
HEPES：1 M = 238.3 g/L，因此 10 mM = 0.59 g/250 mL
MgCl₂：1 M = 203.3 g/L，因此 1.5 mM = 0.076 g/250 mL
KCl：1 M = 74.5 g/L，因此 10 mM = 0.187 g/250 mL
DTT：1 M = 154.2 g/L，因此 0.5 mM = 0.019 g/250 mL
NP-40： 0.05%

细胞核分离实验方案试剂缓冲液 B

5 mM HEPES
1.5 mM MgCl2
​0.2 mM EDTA
0.5 mM DTT
26% 甘油 (v/v)，pH 7.9

要制备 250 mL 缓冲液 B 的母液：
HEPES：1 M = 238.3 g/L，因此 5 mM = 0.295 g/250 mL
MgCl2：1 M = 203.3 g/L，因此 1.5 mM = 0.076 g/250 mL
EDTA：1 M = 372.2 g/L，因此 0.2 mM = 0.0186 g/250 mL
DTT：1 M = 154.2 g/L，因此 0.5 mM = 0.019 g/250 mL
​26% 甘油 (v/v) = 65 mL

TBS 0.025% Triton X-100

1 L 溶液：
250 µL Triton X-100
1 L TBS，pH 7.6–7.8

1.6% H₂O₂（过氧化氢）的 TBS 溶液

400 mL 溶液：
6.4 mL H₂O₂ (GPR = 30% w/w)
393.6 mL TBS，pH 7.6–7.8

一抗的 TBS 溶液（含 1% BSA）

以使用稀释度为 1:10 的一抗为例。

1 mL 溶液：
​100 µL 一抗
10 mg BSA
900 µL TBS，pH 7.6–7.8

生物素化二抗的 TBS 溶液（含 1% BSA）

以使用稀释度为 1:200 的生物素化二抗为例。

1 mL 溶液：
5 µL 生物素化二抗
995 µL TBS，pH 7.6–7.8

ABC（抗生物素-生物素复合物）的 TBS 溶液

以每种组分的使用稀释度为 1:100 的 ABC 为例。

1 mL 溶液：
10 µL 链霉亲和素
​10 µL HRP（或 AP）-生物素
980 µL TBS，pH 7.6–7.8

碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM)

3.03 g Na₂CO₃
6.0 g NaHCO_​3（1 L 蒸馏水），pH 9.6
​PBS：1.16 g Na₂HPO₄
0.1 g KCl
​0.1 g K₃PO₄
​4 g NaCl（500 mL 蒸馏水），pH 7.4

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