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表观遗传学领域正在衍生出许多令人振奋的新分支。其中一条分支是 RNA 修饰研究领域。 RNA 修饰检测和测序方法(例如 m6A单碱基分辨率紫外交联沉淀, miCLIP)开发方面的最新进展意味着在任意种类的细胞或模型生物中发现新的 RNA修饰并将该修饰定位 至不同种类的 RNA 上的过程变的越来越容易,也越来越快速。这项技术的进步使得已知 RNA 修饰数量激增。目前,已知的 RNA 化学修饰 (Roundtree et al., 2017) 已有 100 多种。您会发现这些修饰存在于 mRNA、 tRNA、 rRNA 和其他非编码 RNA(包括 miRNA)上。这些修饰中,每一种修饰都有自己的功能,包括 RNA 结构、输出、稳定性和 mRNA 剪接。该研究领域的未来一片光明;但仍有许多有关部分新修饰功能的内容尚待探索 。
图 1. RNA 修饰在 mRNA 和 tRNA 上的分布。查看我们的 RNA 修饰海报,了解更多内容。
在所有的 RNA 物种中, tRNA 包含的 RNA 修饰最多。 tRNA 内,约五分之一的核苷酸被认为含有 RNA 修饰 (Kirchner et al., 2015)。 tRNA 修饰非常多样化,需要通过多种酶逐步形成。通常情况下,您可以在 tRNA 的反密码子环中发现修饰,修饰有助于通过协助密码子 -反密码子相互作用和防止移码来提高翻译效率 (Stuart et al., 2003)。
RNA 修饰领域相对较新,但每天都在发展。在本节中,我们将对其中的一些方案进行介绍,并提供一些与 RNA 修饰相关的技巧和建议。
获得对您选择的 RNA 修饰具有特异性的抗体可能困难重重。我们有许多被充分引用且经充分验证的 RNA 修饰抗体,包括曾被多篇知名论文引用的 m6A 抗体,这些论文包括一篇发表在 Nature Methods、使用我们的 m6A 抗体进行 m6A 单碱基分辨率测序的论文 (Linder et al., 2015)。同一 m6A 抗体还被一篇 Nature 论文引用,该论文描述了 m6A 在 mRNA 稳定性方面的作用 (Mauer et al., 2017)。请点击此处查看我们 RNA 修饰抗体的完整列表。
RNA 免疫沉淀 (RIP)
RIP 是一种基于抗体的技术,用于绘制体内 RNA-蛋白质相互作用的图谱。目标 RNA 结合蛋白 (RBP) 与其相关 RNA 一起免疫沉淀,以识别结合的转录本( mRNA、非编码 RNA 或病毒 RNA)。通过实时 PCR、微阵列或测序检测转录本。
除转录和后续翻译之外,RNA 的功能还有很多。例如, RNA-蛋白质相互作用能够调节 mRNA 和非编码 RNA 功能。对 RNA 潜在作用的新认识促进了新方法的开发,使得研究人员能够绘制 RNA-蛋白质相互作用的图谱。 RIP 就是这样一种研究单个蛋白质和RNA 分子之间物理关联的方案。
改编自 Khalila et al.(2009), Hendrickson et al. (2009), Hendrickson et al. (2008) and Rinn et al. (2007)
图 2: RIP 实验方案流程示意图。(A) 使用原生方法,不进行交联。方法 (B) 使用甲醛交联。
RIP:技术考量
RNase 污染。使用不含 Rnase 的试剂(如无 Rnase 的吸头、试管和试剂瓶)避免污染。使用不含 DNAase、不含 Rnase 的超纯蒸馏水制备缓冲液和溶液。
严谨地设置对照。整个实验过程中应保持一个或多个阴性对照品,例如无抗体样本或来自基因敲除细胞或组织的免疫沉淀。不推荐使用敲除细胞进行阴性对照实验。
下游分析。从您的下拉列表中分离出来的 RNA 可以使用多种技术分析。根据您要回答的问题选择最佳方法,并使用多种方法确认您的结果。例如,您使用 RIP-seq 获得的任何新发现都应该使用 RIP-qPCR 进行确认。
CLIP 是一种基于抗体的技术,用于研究与 RNA 免疫沉淀 (RIP) 相关的 RNA-蛋白质相互作用,但与 RIP 的不同的是,CLIP 使用紫外线交联 RNA 结合蛋白与 RNA。这种共价键是不可逆的,因而兼容严苛的纯化条件。与 RIP 不同,CLIP 提供有关 RNA 上实际蛋白结合位点的信息。
CLIP 可分为不同的类型,包括高通量测序 CLIP (HITS-CLIP)、光活化核糖核苷增强 CLIP (PAR-CLIP) 和单核苷酸分辨率交联免疫沉淀 (iCLIP)。
您可以查看我们根据 Konig et al. J.Vis.Exp. 2011.“ICLIP-全转录组蛋白质 -RNA 相互作用的映射与个体核苷酸分辨率”改编的完整 CLIP 实验方案。
图 3. CLIP 实验方案流程示意图。
CLIP:技术考量
4-硫尿苷预孵育 4-硫尿苷预孵育和 UV-A 交联等可选步骤对某些蛋白质而言可能是必需的。4-硫尿苷可增强某些蛋白质的交联。详情见完整实验方案。 优化抗体浓度开始实验之前,应优化所需的抗体量 (Huppertz et al., 2014)。无抗体样本是很好的阴性对照品。如果您以前未曾使用 CLIP 对您的目标靶标进行过研究,您可以先使用在 IP 中有效的一种抗体,在 IP 中 的有效性即提示该抗体在 CLIP 中也会有效。
miCLIP
尽管 m6A 是真核生物 mRNA 中含量最丰富的修饰碱基,但目前对其进行准确研究的方法仍存在局限性。绘制 m6A 高分辨率图谱的新方法对理解这种表观遗传 RNA 修饰而言至关重要。
miCLIP 可以对整个 RNA 中的单个 m6A 残基和 m6A 簇进行高分辨率检测(图 14)。使用 miCLIP, 可以在人和小鼠 mRNA 中以单核苷酸分辨率绘制 m6A 和相关二甲基化形式 m6Am(N6,2'-O-二甲基 腺苷)(Linder et al., 2015)。
miCLIP 适用于较小的 RNA。该实验方案 (Linder et al., 2015) 的作者发现,一类非编码小 RNA,小 核仁 RNA (snoRNA) 中存在 m6A 修饰。若利用缺乏特异性且生物信息学存在挑战的旧技术,这一发现则是很难实现的。
miCLIP:技术考量
非 100% 准确。该方法无法识别修饰残基的具体位置,只能确定 m6A 位点的大致位置。
生物信息学 m6A 调用中的偏差。数据分析使用基于已知共有序列的假设,这些序列含有 m6A 残基,因此忽略了这些基序以外的修饰。
图 4.miCLIP 实验方案流程示意图
液相色谱串联质谱法 (LC/MS-MS)
与 DNA 修饰类似,如果您可以使用 LC-MS/MS,那么 LC-MS/MS 是量化总 RNA 内 RNA 修饰量的最佳方法。此外,类似于检测 DNA 修饰,您可以使用绝对定量法,这种方法仅受您可以用作样本 检测标准品的同位素标准品的限制。
使用该技术并结合 RIP (RIP-MS),您可以确定您的 RNA 修饰抗体是否与您的目标修饰进行了结合, 而且可以查看它是否与任何其他非特异性修饰进行了结合。如果您利用 RIP input 和下 pull-down 样本 得到了 LC-MS/MS 数据,您应该可以看到,相较 input 而言,pull-down 样本中的目标修饰得到了富集。 您还可以使用这些数据检测其他修饰,查看您的样本中是否有其他成分增加,以检测非特异性抗体结合。
LC/MS-MS:技术考量
技术挑战。质谱设备非常昂贵且非常专业。机器本身需要大量的维护,并且往往要求其自身的技术人员掌握一切运行情况。机器操作非常复杂,需要专门的培训,因此您自己可能很难获得这种类型的质谱数据。如果您无法购买自己的 LC/MS-MS 设备,可以考虑通过合作或有偿服务获得这些数据。
RNA 修饰对照实验
由于 RNA 修饰的性质,其化学结构通常极为相似。为了确保您从您的抗体中获得最准确的结果,您需要在您的模型系统中对其进行完全检测。RNA 修饰抗体的对照品可以使用一系列的应用来完成。为简化您的 RNA 修饰研究,请查看下方我们提供的一些高级对照和提示。
RNase 处理
不管您是进行 ICC/IHC 还是进行 RIP-qPCR,都有必要为您的实验样本设置一个经 RNAse 处理的对 照品 (Delatte et al., 2016)。举个例子,如果您在您的实验 IHC 样本中看到一个清晰、明亮的信号,但 在 RNAse 处理的对照样本中未得到信号,您可以确信您得到的信号来自 RNA,而不是来自非特异性 来源的背景信号。这意味着抗体识别的是 RNA 内的修饰,而非 DNA 内的修饰。
DNAse 处理
除了 Rnase 处理的对照品,您还应该设置经 DNAse 处理的对照品。如果您担心您的 RNA 修饰抗体 正在识别 DNA 内的一种类似修饰,最好用 DNAse 处理您的样本,并对此进行检测。许多修饰都会同时存在于 RNA 和 DNA 内,所以这个问题很常见。举个例子,DNA 内的 5mC 与 RNA 内的 m5C 的化学修饰相同。
竞争法检测
确保 RNA 修饰抗体特异性的另一种方法是使用竞争法检测。竞争法检测使用的是包含合成修饰的寡 核苷酸,可与您的抗体一并预孵育 (Meyer et al., 2012)。您在您的应用(例如 ICC/IHC 或斑点印迹) 中使用这种预孵育抗体时,与单独使用抗体染色的样本比较后,您应该会看到获得的信号有所降低。 您可以尝试将竞争性寡核苷酸添加到您的抗体溶液中,并不断增加溶液浓度;您会看到信号呈梯度递 减,反映了您添加到抗体中的竞争物的量。例如,尝试按 0 ng、10 ng、100 ng 和 1 µg 的梯度添加竞 争性寡核苷酸。
斑点印迹法 (Dot blot)
使用 RNA 修饰抗体进行斑点印迹法是检测其特异性的一个快速而简单的方法。斑点印迹法类似于简化版本的蛋白质印迹法。该技术的操作方法为,将样本直接点样到膜上,交联,然后进行印迹。更多详情,请查看我们的斑点印迹法实验方案。如果您可以获得包含目标修饰的合成 RNA 分子,可以将 其作为最佳阳性对照品。同样,装载未修饰的分子或含有不同修饰的分子可以作为阴性对照品,并帮助您测量任何非特异性结合或交叉反应性。
RIP-MS
要是您能够使用 LC-MS/MS,那么 LC-MS/MS 确实是检测 RNA 修饰抗体特异性的最佳方法 (Kellner et al., 2014)。使用该技术并结合 RIP (RIP-MS),您可以确定您的抗体是否仅与您的目标修饰进行了结合。
参考文献
Delatte B, Wang F, Ngoc LV, Collignon E, Bonvin E, Deplus R, Calonne E, Hassabi B, Putmans P, Awe S, Wetzel C, Kreher J, Soin R, Creppe C, Limbach PA, Gueydan C, Kruys V, Brehm A, Minakhina S, Defrance M, Steward R, Fuks F.RNA biochemistry. Transcriptome-wide distribution and function of RNA hydroxymethylcytosine. (2016) Science. 2016 15:282-5
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