ChIP 样本需求量降低

关于低输入样本染色质免疫沉淀(ChIP)的新策略。

​​标准 ChIP 工作流程要求起始样本量为约 106 至 107 个细胞,如果低于该样本量,由于高背景结合、低富集效率和富集文库复杂性丧失,检测会受到阻碍。

改善富集效率和样本损失

​​为了解决这一问题,已经提议针对低输入样本对 ChIP 工作流程进行若干调整,以提高富集效率1 并最大限度地减少样本损失2

  • 样本本身的质量和性质是重点考虑因素,并且起始材料通常是福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE),在该组织中,过度交联会引起问题。已经开发了从 FFPE 样本中提取可溶性染色质的方法3
  • 可以优化影响低浓度抗原免疫沉淀动力学的许多变量,包括缓冲液 pH、离子强度和孵育时间4
  • 微球菌核酸酶(MNase)是一种内切核酸外切酶,可以消化 DNA,直至遇到某些阻碍,例如核小体或结合蛋白。可以使用 Mnase 代替或补充有限的超声处理,以剪切交联的 DNA 并避免阻碍低输入 ChIP 的广泛片段大小分布5
  • 虽然标准 ChIP 有时会使用细菌 DNA 作为封闭剂,但不建议将其用于低输入 ChIP,因为其可进行检测并干扰数据分析。其他封闭剂(如惰性蛋白)或 mRNA 可以减少低输入 ChIP 中的背景结合,而不污染数据2
  • 将检测试剂小型化为微孔板格式有助于自动化,并在 IP 工作流程中提高抗原浓度(靶转录因子)– 这避免了低抗原浓度的“稀释效应”,有利于抗体:抗原复合物的解离4,并降低 ChIP 的效率。
  • 每个测定步骤完成后,采用单管测定形式和磁珠或 SPRI 珠纯化(而非基于苯酚的提取)来最大限度地保留样本。
  • 抗体固定和洗涤等去除非抗体结合材料的步骤经常被忽视。标准方案使用蛋白 A/G 来实现这一目的。替代方案建议使用表位标记蛋白6,但这些蛋白存在过度表达和伪影引入风险。

Abcam 高灵敏度 ChIP 检测采用独特的嵌合蛋白来捕获抗体结合蛋白与 DNA 复合物,有着显著优势:捕获蛋白小于蛋白 A 或 G,并在微量滴定板孔的表面以高密度包被,可以在更小的区域内提供更高数量的 IgG 固定位点,从而确保了洗脱 DNA 的效率和浓度。此外,嵌合捕获蛋白在更广的 pH 和盐浓度范围内显示出优秀的稳定性,适用更严格的洗涤条件。


平台选择和下游样本处理

除了检测本身,下游处理(即测序、阵列或 PCR)和生物信息学分析的选择和优化同样重要。

​​参见使用少量样本进行 ChIP-seq 分析的进展

  • 检测平台的选择会影响检测的灵敏度。ChIP 测序(ChIP-seq)已成为高灵敏度 ChIP 的黄金标准平台,因为相较 ChIP-on-chip 而言,它能提供稳定的低噪声7
  • 低输入 ChIP-seq 实施过程中最常见的问题在于大量不可定位的读段、PCR 重复序列和较低的文库复杂性。后者需要按照上文所述最大限度地提高 ChIP 富集效率,同时针对低输入样本优化测序用的文库制备,关键在于优化接头连接点8,9以及避免扩增衍生的误差和偏倚。
  • 应调整生物信息学工作流程,以考虑数据中可能存在的过程衍生偏差10


Abcam 高灵敏度 ChIP 检测

着手低样本输入量的 ChIP 可能会让人望而却步。但我们已经特地为此开发出了高灵敏度 ChIP 试剂盒(ab185913)

  • 最低只需 2 x 103 个细胞或 0.5 mg 组织即可成功运行 ChIP
  • 相对富集因子 > 500x
  • 从细胞/组织到富集 DNA 的快速、5 小时方案
  • 微孔板检测格式,可灵活地进行样品通量和自动化(可用于单孔、8 孔板或 96 孔板格式)

发现更多 ChIP 资源


参考文献

1.    Mao。Accounting for immunoprecipitation inefficiences in the statistical analysis of ChIP-Seq data. BMC Bionformatics.14, 169 (2013).

2.   Dirks, R. Genome-wide epigenomic profiling for biomarker discovery. Clinical Epigenetics.8, 122.(2016)。

3.    Cejas, P. Chromatin Immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nature Medicine.22, 685.(2016)。

4.    Reverberi, R. Factors affecting the antigen-antibody reaction. Blood transfusion.5, 227.(2007)。

5.    Gilfillian, G. Limitations and possibilities of low cell number CHIP-SEQ. BMC Genomcis.13, 645.(2012)。

6.    Xiong, X. A scalable epitope tagging approach for high throughput ChIP-Seq analysis. ACS Synth biol .(2017, Feb 19).

7.    ENCODE。(n.d.). ENCODE Platform Comparison. Retrieved from https://genome.ucsc.edu/ENCODE/platform_characterization.html

8.    Schmidl, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-Seq for histones and transcription factors. Nature Methods.12, 963.(2015)。

9.    Bolduc, N. Preparation of low-input and ligation-free librarles using template-switching technology. In Current protocols in molecular biology (Vol. Unit 7.26).Wiley & Sons.(2016)。

10.  Kidder, B. ChIP-Seq: Technical considerations for obtaining high quality data. Nature Immunology.12, 918.(2011)。

11.  Stelloo, S. Androgen receptor profiling predicts prostate cancer outcome. EMBO Mol Med.7, 1450.(2015)。

注册