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表观遗传学应用指南

了解表观遗传学的关键领域,包括组蛋白修饰、染色质结构、DNA 和 RNA 修饰。

​​为什么表观遗传学如此重要

人类基因组计划的完成和新一代测序技术的进步揭示了基因组 DNA 对生物过程和疾病状态的控制比最初想象的要少得多。相反,表观遗传因素决定了 DNA 如何翻译,严格调控 DNA 结构,进而控制哪些基因在什么时间表达。

许多表观遗传因素共同协调从发育过程到细胞死亡通路的基本细胞程序。这些因素中的任何一项出现功能障碍都会扰乱基因组的调控,导致细胞过程出错,引发癌症及自身免疫紊乱、神经系统疾病、不孕不育等疾病。

为彻底了解生物学或疾病的所有方面,有必要对可能起作用的表观遗传因素进行研究。本指南包含表观遗传调控的概述,以及在健康和疾病状态中如何研究这些关键参与者。

如何研究表观遗传学

表观遗传调控发生在许多相互作用的水平上,平行检查所有这些水平,从而描绘表观遗传学如何促进生物学过程的全貌很重要。忽视表观遗传调控中的任何一个方面都可能得出错误的结论。采用冗余方法从多个角度处理表观遗传学研究是确保结果准确的关键。

表观遗传学是一个非常活跃的研究领域,不断发现基因组调控的新机制和相互作用。不同的染色质标记集与不同的调控结果相关,并被认为是表观遗传同一性的载体,尽管将这些标记与功能性结果联系起来的精确机制才刚开始出现。

目前,表观遗传调控有 5 个基本方面值得研究。

1.染色质结构和可及性: 基因组 DNA 被包装并组织成染色质,以适合每个细胞的细胞核。基因组的一些区域包装紧密,无法进行转录,导致基因沉默。其他区域处于开放构象,允许转录因子和活跃基因转录的转录机器结合。了解在不同的细胞或疾病状态下,哪些基因组区域在整个基因组中是活跃的与非活跃的,可以成为确定关键通路和相关基因的重要步骤。​
2. 组蛋白修饰: ​组蛋白是负责包装 DNA 的蛋白质。组蛋白可能被多种机制修饰,包括乙酰化、甲基化和磷酸化,以控制其与 DNA 的相互作用,以及 DNA 的结构和基因激活。检查组蛋白修饰,以及控制这些修饰的酶的活性,可以揭示特定基因位点或整个基因组的表观遗传调控和失调的机制。​
3. DNA 结合蛋白: 许多不同类型的蛋白质与 DNA 结合,直接或间接调控染色质构象和基因转录。其中包括转录因子、RNA 聚合酶和许多其他可能直接结合 DNA 的蛋白质,或者是染色质重塑复合物和转录机器的成员。识别特定区域或整个基因组中是否存在这类蛋白,可以提供表观遗传调控和失调的全貌,并指出所涉及的特定参与者和通路。表观遗传调控的这些方面可以用日益强大的染色质免疫沉淀 (ChIP) 技术进行研究。​

4. DNA 修饰组蛋白修饰一直以来都是表观遗传学研究领域的核心内容,然而,越来越多的研究表明 DNA 修饰在基因调控中发挥着重要的作用。在整个 DNA 中,许多化学修饰存在于 DNA 序列中。这些化学修饰中,研究得最透彻的是 5-甲基胞嘧啶 (5mC),这种修饰被普遍视为基因表达的一种稳定的、抑制性的调节因子。最近,更多的 5mC 和 DNA 内其他化学修饰案例表明,这些标记在基因调控中具有表观遗传作用。确定这些标记及其在生物学中的作用是表观遗传学目前一个非常令人兴奋的领域。​

5. RNA 修饰: 表观遗传学一个非常振奋人心的新兴领域是 RNA 修饰研究。新的 RNA 修饰正在被发现,现有修饰的新功能也正在被发现。许多被认为只存在于细菌中的 RNA 修饰正在真核细胞中被发现。RNA 修饰虽然只存在于某些特定的 RNA 物种,如 tRNA,但现在发现其在哺乳动物的 mRNA 翻译中起着至关重要的作用。RNA 修饰这一课题目前非常火热,对该领域的研究尚有很多内容需要探索。

1.染色质可及性和结构
​基因组被有效地包装到细胞核中。DNA 缠绕在组蛋白周围,形成核小体,由 147 个碱基对的 DNA 和 8 个核心组蛋白组成。核小体像串珠一样串接在一起,包装成更高阶的染色质结构(图 1)。

DNA wraps around the histone proteins to form nucleosomes

重塑  ​ 图一:染色质结构​  DNA 缠绕在核小体周围,形成染色质纤维及染色体

在核小体中紧密结合或被压缩成更高级别的异染色质的 DNA 是不可接近的,因此阻止了转录因子、转录机器和其他 DNA 结合蛋白的结合,从而导致基因沉默。同时,“接头”DNA 和开放的常染色质结构易于结合,允许活跃的基因转录。

染色质被主动和动态地重塑,以改变基因表达和细胞编程,例如在不同的发育状态下或响应特定的刺激时。大的基因组区域可能被沉默或激活,或者核小体可能被解开,以访问特定的基因和 DNA 序列。

检查染色质结构和核小体定位,以及其中的、特定位点和整个基因组的变化,可以揭示参与特定细胞过程和疾病状态的表观遗传程序和机制。

研究 DNA 可及性的方法

在不同的背景下研究染色质结构和功能之间的关系时,首要步骤是检测可以进行活跃转录的暴露区域对比与异染色质紧密结合的暴露区域的基因组。为了拍摄基因组架构的快照,研究人员可以使用以下 3 种方法之一:DNaseq、MNase-seq 或 ATAC-seq。

DNase-seq 和 ATAC-seq 绘制 DNA 的暴露区域,而 MNase-seq 绘制受核小体保护的区域。重要的是要记住,这些方法提供了动态过程的快照,通常在数千个细胞中进行平均。如果一个特定的区域呈动态变化趋势,或者群体内细胞之间存在差异,数据可能会混乱,或者方法之间似乎有冲突。例如,该区域在一些细胞中可能与核小体结合,但在另一些细胞中或在不同时间处于游离状态。为了解决这些挑战,正在开发一些单细胞分析方法。

DNAse-seq
该技术利用 DNase 消化基因组的暴露区域,而核小体结合的 DNA 则免受 DNase 消化的影响。然后对 DNase 消化产生的小片段进行测序并将其定位到基因组,以确定活跃转录的区域。​

优势

  • 最成熟和熟练的方法
  • DNase 切割偏倚已得到充分理解
  • 可用于反向检查受保护的基因组区域,称为 DNase 足迹法,以鉴定转录因子和核小体结合位点。但是,对于这样的实验,使用裸 DNA 作为对照很重要,因为 DNase I 切割偏倚会导致错误的结论
  • 可能适合单细胞分析

缺点:

  • 技术上很难掌握,尤其是在针对给定细胞类型/数量优化消化条件的情况下
  • 需要数以百万计的细胞,对于罕见患者样本的分析可能具有挑战性

MNAse-seq

相反,MNase-seq 使用微球菌核酸酶 (Mnase),来自金黄色葡萄球菌,用于消化暴露的基因组区域。然后回收与核小体结合的受保护 DNA 并测序。

优势:

  • 从酵母到人类,在许多物种的许多细胞类型中都很常见且很确定,消化和数据分析实现了一定的标准化
  • 可与染色质免疫沉淀 (ChIP-seq) 结合使用,研究与核小体结合的调控因子
  • 可用于生成碱基对分辨率映射
  • 可用于检查 NOMe-seq 中的核小体定位和 DNA 甲基化状态

缺点:

  • 需要大量细胞:1000-2000 万个细胞
  • AT 富集区消化中存在序列特异性偏倚(尽管在染色质可及性检测中使用的大多数酶都表现出了相似的偏倚),但也存在可能歪曲结果的未知偏倚
  • 尚无法进行单细胞分析
ATAC-seq

确立于 2013 年,转座酶可接近性染色质 (ATAC)-seq 检测法使用酶 Tn5 转座酶将测序接头直接插入可接近的 DNA。然后用 qPCR 扩增接头之间的 DNA 并测序。

更详细地说,ATAC-seq 使用了一个突变的高活性 Tn5 转座酶,它预先装载了 DNA 接头,以同时用序列接头对基因组进行片段化和贴标(这个过程称为标签化)。接下来是 PCR 扩增和 NGS 测序。一个区域中序列的频率与开放染色质构象相关。

请点击此处查看我们提供的 ATAC-seq 逐步指导。

优势:

  • 最简便的方法:无需超声、酚-氯仿抽提、抗体 (ChIP-seq) 或酶消化 (DNase-seq、MNase-seq)
  • 最快的方法:与长达 4 天的方案相比,不到 3 小时
  • 最佳信噪比
  • 仅需 50,000 个或更少的细胞(推荐 500-50,000 个)
  • 可能的单核苷酸分辨率
  • 通过采用流式细胞术/微流体技术的改编方案,可进行单细胞分析

缺点:

  • 更贵,需要使用 Illumina 公司的试剂盒 (Nextera DNA Library Preparation Kit)。
  • 成熟度较低,需要针对特定的细胞类型、组织和生物体优化细胞数量和裂解条件,才能获得理想的片段分布。细胞数量定义了数据的质量,细胞过少或细胞过多会导致过度转位或转位不足,从而导致结果失真。


染色体构象技术 (3C)

​​三维染色质结构可以用染色质接触图谱来评估,揭示了远距离基因组区域之间的物理相互作用。染色质构象捕获 (3C) 的出现以及由此方法产生的后续方法使得这种类型的作图成为可能。这些方法中的每一种对于特定应用都具有特殊的优势;然而,由于方法的决对多样性,出于特定目的选择一种方法可能具有挑战性。

染色质构象捕获
3C 利用甲醛交联将 3 维染色质结构锁定到位,接着进行限制性酶切。然后通过 qPCR 和测序分析切除的 DNA 片段,以确定远端 DNA 区域连接的位置。这种用于分析体内 3D 染色质结构和相互作用的方法于 2002 年首次开发 (Dekker et al., 2002),现已成为为实现更大规模、通量或特异性而开发的一系列相关技术的基础。

环状染色体构象捕获 (4C)
4C 能够识别与目标位点相互作用的先前未知的 DNA 区域,使得 4C 非常适用于发现正在研究的特定区域内的新的相互作用 (Dekker et al., 2006)。

4C帮助性提示:

  • 选择合适的限制性内切酶。更频繁的切割者(即 4 个 bp 识别位点)更适合目标区域和同一染色体上邻近序列之间的局部相互作用 (van der Werken et al., 2012)。
  • 为您的实验找到匹配的交联严格性。较低的甲醛浓度促进了不合需要的目标区的自我连接,但也阻止了阻碍限制性内切酶切割的 DNA“毛球”。较高的甲醛浓度降低了自连接事件,但增加了毛球。对于特定的实验情况,应选择最佳的甲醛浓度来平衡这些考虑。对于大多数实验而言,开始最好采用 1% 甲醛处理 10 分钟 (van der Werken et al., 2012)。
碳拷贝染色体构象捕获 (5C)

这种技术产生了一个来自与目标位点相关的 DNA 区域的任何连接产物的文库,然后通过新一代测序进行分析。需要有关给定区域中所有相互作用的详细信息时,例如绘制特定染色体的详细相互作用矩阵时,5C 是理想的选择。然而,5C 不是真正的全基因组,因为每个 5C 引物必须单独设计,因此其最适合特定区域(Dotsie 和 Dekker,2007)。

5C 帮助性提示:

  • 选择合适的限制性内切酶。对于 5C 来,这一任务比 4C 简单得多,因为 5C 不需要考虑限制位点围绕目的区域的分布。然而,选择一种在您的特定实验条件下高效发挥作用的酶很重要。例如,由于 BamHI 在 3C 条件下的效率低,大多数实验不推荐使用 BamHI (Dotsie et al., 2007)。优化引物设计。这是 5C 的关键,与其他 3C 技术略有不同。5C 使用两种引物:结合在连接位点上游的正向 5C 引物和紧邻下游的反向引物。应调整引物长度
  • ,使退火温度在 65℃ 左右,使引物与其限制性片段完全退火。确保 5C 引物在 5’端合成一个磷酸盐,用于连接。
  •  尝试使用对照模板。这将控制引物效率的差异。建议从研究的整个基因组区域构建对照文库。但是,在一项大规模的研究中,这个建议可能是不合理的,大多数研究人员会选择跳过这一步。如果没有构建这个文库,那么研究人员应该意识到相互作用频率会更不精确。
通过末端配对标签测序 (ChIA-PET) 进行染色质相互作用分析

ChIA-PET 采用染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 3C 的特征来分析通过特定蛋白质的远端 DNA 区域的相互作用。

ChIA-PET 最适合用于涉及目的蛋白和未知 DNA 结合靶标的发现实验。例如,最好用 ChIA-PET 研究转录因子结合位点,因为该技术要求 DNA 在体内与转录因子结合,这样才能产生所谓的相互作用 (Fullwood et al., 2009)。

ChIA-PET 帮助性提示:

  • 重叠 PET 标签以减少背景。与大多数 3C 技术一样,背景噪声是一个巨大的技术挑战。特别是在 ChIA-PET 中,噪声使得找到与目标轨迹之间的真正的长程相互作用变得困难。克服这个问题有一个有用技巧,就是要求 PET 在区域的两端重叠成为真正的远程交互。
ChIP-loop
ChIP-loop 是染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 3C 的混合物,其采用的抗体靶向至疑似结合目标 DNA 区域的蛋白。ChIP-loop 是找出两个已知的 DNA 区域是否通过目的蛋白相互作用的理想工具。这一技术非常适合用于确认疑似相互作用,但不适用于发现新的相互作用 (Horike et al., 2005)。


ChIA-loop 帮助性提示:

  • 避免非天然环。ChIP-loop 遇到的最大问题是在连接发生之前的 DNA 浓缩过程中形成非天然环。避免这种情况的简单方法是选择在连接步骤完成后再进行沉淀的方案 (Simons et al., 2007)。
  • 验证 ChIP-loop 的相互作用。ChIP-loop 实施过程中面临的另一个挑战是准确定量连接产物。3C 技术经常捕获随机相互作用,尤其是 ChIP-loop。为了解决这个问题,可以考虑并行地执行一个 ChIP 实验,用来验证 ChIP-loop 的相互作用。如果通过 ChIP-loop 识别的 DNA-蛋白质-DNA 相互作用的确属实,那么两种 DNA-蛋白质的相互作用也应该出现在 ChIP 数据中 (Simons et al., 2007)。
Hi-C

Hi-C 扩增与所需 DNA 位点相互作用的整个基因组的连接产物,然后通过高通量测序评估其频率。需要广泛覆盖整个基因组时,Hi-C 是一个很棒的选择,但分辨率不是很值得关注。例如,绘制肿瘤细胞染色体结构的全基因组变化 (Lieberman-Aiden et al., 2009)。


Hi-C 帮助性提示:

> 优化文库扩增。Hi-C 文库扩增必须生成足够的产物用于分析,同时避免 PCR 伪影。为此,应优化 PCR 循环次数(保持在 9-15 个循环范围内)。如果不能产生足够的产物 (50 ng DNA),应合并多个 PCR 反应,而不是增加循环数,通常 5 个反应就足够了 (Belton et al., 2012)。

> 天平读长。与任何序列实验一样,高质量的读数至关重要。读长必须是平衡长读长映射相互作用的需要的最佳读长,但不能太长,以通过连接点进入伴侣片段。因此,在大多数情况下,50 bp 是最佳读数 (Belton et al., 2012)。

> 选择适当的测序单元大小。这一点对于数据分析至关重要。测序单元大小应与区域中预期相互作用的数量成反比。对于较为频繁的染色体内相互作用,使用较小的测序单元 (bin);对于较不频繁的染色体间相互作用,使用较大的测序单元 (Belton et al., 2012)。


Capture-C
Capture-C 将 3C 和寡核苷酸捕获技术 (OCT) 相结合,加上高通量测序,一次可研究数百个位点。需要高分辨率和全基因组范围时,Capture-C 是一个完美的选择。例如,分析基因组中每个疾病相关 SNP 对局部染色质结构的功能影响 (Hughes et al., 2014)。

Capture-C 帮助性提示:

  • 小心选择探针位置。最好将探针靠近限制性内切酶位点,甚至在可能的情况下重叠 (Hughes et al., 2014)。
  • 保持文库的复杂性。维护文库的复杂性是当务之急。复杂的文库意味着输出中有更多高质量的交互作用。因此,应避免任何可能降低文库复杂性的操作,例如 Hi-C 生物素捕获 (Hughes et al., 2014)。
  • 观察重复区域中的错误交互。作图过程可以刺激实际是伪迹的这些区域(例如假基因)之间的强相互作用 (Hughes et al., 2014)。
选择 3C 方法

大量可用的 3C 相关技术可能会使仅选择众多选项中的一种变得困难,但这也意味着可能存在一种非常适合任何实验场景的选项。下表可以帮助指出每个方法真正具有优势的方面。

随着不断的发展,C 方法变得更加精细,其用途也不断扩大,它们将成为未来几年理解染色质结构、蛋白质相互作用和 DNA 序列如何共同控制基因表达的宝贵工具。



2. 组蛋白修饰

染色质结构、核小体定位和最终获得 DNA 的基因转录在很大程度上由组蛋白控制。每个核小体由 8 个核心组蛋白组成:组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 各两个亚基。同时,H1 蛋白,作为连接组蛋白,稳定核小体间 DNA,且不构成核小体本身的一部分。

组蛋白可以以不同的方式进行翻译后修饰,影响其与 DNA 的相互作用。一些修饰破坏了组蛋白-DNA 相互作用,导致核小体解旋。在这种开放的染色质构象(称为常染色质)中,DNA 可以与转录机制结合,导致基因激活。相反,加强组蛋白-DNA 相互作用的修饰会产生一种紧密排列的染色质结构,称为异染色质。在这种紧凑的形式中,转录机制无法接近 DNA,导致基因沉默。通过这种方式,染色质重塑复合物对组蛋白的修饰改变了染色质结构和基因激活。

目前已发现至少 9 种不同类型的组蛋白修饰。乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化最容易理解,而乙酰葡萄糖胺糖基化、瓜氨酸化、krotonilation 和异构化是最近发现的,尚待深入研究。这些修饰中的每一种修饰都是由一组特定的酶从组蛋白的特定氨基酸残基上添加或去除的。


​​

图 2: 最常见的组蛋白修饰。如欲了解更多,请参阅我们完整的组蛋白修饰海报

总之,这些组蛋白修饰组成了所谓的组蛋白密码,而组蛋白密码决定了局部基因组区域的转录状态。检查特定区域,或整个基因组的组蛋白修饰,可以揭示基因激活状态、启动子、增强子和其他基因调控元件的位置。

详细的组蛋白修饰

乙酰化​

乙酰化是目前研究最广泛的组蛋白修饰之一,也是最早发现的影响转录调控的组蛋白修饰之一。乙酰化使 N-末端组蛋白尾部的赖氨酸残基带负电荷,从核小体伸出。这样会排斥带负电荷的 DNA,并导致染色质结构松弛。开放的染色质构象允许转录因子结合并显著增加基因表达。

组蛋白乙酰化严格参与细胞周期调控、细胞增殖和凋亡,并在调节细胞分化、DNA 复制和修复、核输入和神经元抑制等多种细胞过程中发挥重要作用。组蛋白乙酰化平衡失调与肿瘤发生和癌症进展有关。

酶调节:
乙酰基被组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 特异性地添加到组蛋白 H3 和 H4 的赖氨酸残基上,并被去乙酰化酶 (HDAC) 除去。组蛋白乙酰化主要针对启动子区域,称为启动子局部乙酰化。例如,组蛋白 H3(H3K9ac 和 H3K27ac)上 K9 和 K27 的乙酰化通常与活性基因的增强子和启动子相关。在转录基因中也发现了低水平的整体乙酰化,其功能尚不清楚。

甲基化:

组蛋白 H3 和 H4 的赖氨酸或精氨酸残基被甲基化,对转录有不同的影响。精氨酸甲基化促进转录激活 1,而赖氨酸甲基化参与转录激活和抑制,具体取决于甲基化位点。这种灵活性可以解释为甲基化不改变组蛋白电荷,以直接影响组蛋白-DNA 相互作用,与乙酰化不同。

赖氨酸可以是单甲基化、双甲基化或三甲基化,为每个甲基化位点提供进一步的功能多样性。例如,组蛋白 H3(H3K4me1 和 H3K4me3)的 K4 上的单甲基化和三甲基化都是活化标志物,但具有独特的细微差别:H3K4me1 典型地标记转录增强子,而 H3K4me3 标记基因启动子。同时,K36 (H3K36me3) 的三甲基化是与基因体内转录区域相关的激活标记。

相反,组蛋白 H3 (H3K9me3 & H3K27me3) 的 K9 和 K27 上的三甲基化是具有独特功能的抑制信号:H3K27me3 是控制胚胎干细胞中发育调控因子(包括 Hox 和 Sox 基因)的启动子区域的一个临时信号。同时,H3K9me3 是在具有串联重复结构的基因贫乏染色体区域形成异染色质的永久信号,如卫星重复序列、端粒和近着丝粒区。它也标记反转录转座子和特定的锌指基因家族 (KRAB-ZFPs)。这两个标记均在失活的 X 染色体上发现,H3K27me3 位于基因间和沉默的编码区,H3K9me3 主要位于活性基因的编码区。

酶调节:

组蛋白甲基化是一种通过多次细胞分裂繁殖的稳定标记,多年来一直被认为是不可逆的。但是,最近发现它是一个主动调控和可逆的过程。

甲基化:组蛋白甲基转移酶 (HMTs)

  • 赖氨酸:包含 SET 结构域(组蛋白尾部)
  • 含有非 SET 结构域(组蛋白核心)
  • 精氨酸:PRMT(蛋白质精氨酸甲基转移酶)家族

去甲基化:组蛋白脱甲基酶类

  • 赖氨酸:KDM1/LSD1(赖氨酸特异性脱甲基酶 1)
  • JmjC(含 Jumonji 域)
  • 精氨酸:PAD4/PADI4
磷酸化:

组蛋白磷酸化是细胞分裂、转录调控和 DNA 损伤修复过程中染色体浓缩的关键中间步骤。与乙酰化和甲基化不同,组蛋白磷酸化建立了其他组蛋白修饰之间的相互作用,并作为效应蛋白的平台,导致下游级联事件。

磷酸化发生在所有的核心组蛋白上,对每一个都有不同的作用。组蛋白 H3 在丝氨酸 10 和 28 上的磷酸化,以及组蛋白 H2A 在 T120 上的磷酸化参与了染色质的致密化以及有丝分裂过程中染色质结构和功能的调节。这些是细胞周期和细胞生长的重要标志,在真核生物中得以保留。S139 处 H2AX 的磷酸化(产生 γH2AX)作为 DNA 损伤修复蛋白的招募点,是 DNA 双链断裂后最早发生的事件之一。对 H2B 磷酸化的研究还不够深入,但发现 H2B 磷酸化可促进凋亡相关的染色质浓缩、DNA 断裂和细胞死亡。


泛素化:

所有组蛋白核心蛋白都可以被泛素化,但 H2A 和 H2B 是最常见的,也是细胞核中两个最高度泛素化的蛋白 [10]。组蛋白泛素化在 DNA 损伤反应中起核心作用。

在 DNA 双链断裂位点发现了组蛋白 H2A、H2B 和 H2AX 的单泛素化。最常见的形式是 K119 上的单泛素化 H2A 和 K123(酵母)/K120(脊椎动物)上的 H2B。单泛素化 H2A 也与基因沉默有关,而 H2B 也与转录激活有关。

多聚泛素化较少见,但在 DNA 修复中也很重要 — H2A 和 H2AX 在 K63 上的多聚泛素化为 DNA 修复蛋白提供了一个识别位点,如 RAP80。

酶调节:

与其他组蛋白修饰一样,H2A 和 H2B 的单泛素化具有可逆性,并受到组蛋白泛素连接酶和去泛素化酶的严密调控。

单泛素化:

  • H2A:多梳基团蛋白
  • H2B:Bre1(酵母)及其同系物 RNF20/RNF40(哺乳动物)

多聚泛素化:

  • H2A/H2AX K63:  RNF8/RNF168  

组蛋白修饰快速参考指南
最常见的组蛋白修饰及发现位置:



组蛋白修饰

功能

位点

H3K4me1

活化

增强子

H3K4me3

活化

启动子

H3K36me3

活化

基因体

H3K79me2

活化

基因体

H3K9Ac

活化

增强子和启动子

H3K27Ac

活化

增强子和启动子

H4K16Ac

活化

重复序列

H3K27me3

阻遏

启动子,基因富集区域

H3K9me3

阻遏

卫星重复序列、端粒、近着丝粒区

伽马 H2A.X

DNA 损害

DNA 双链断裂

H3S10P

DNA 复制

有丝分裂染色体

研究组蛋白修饰的方法
入门 - 样本制备
在表观遗传学研究中,良好的起始物料是获得良好数据的关键。因此,样本制备是获得高质量结果的关键首要步骤,可能因预期应用而异。找到最适合您的以下研究的提取方法。选择相应的样本制备试剂盒,这些试剂盒已被 Abcam 优化,可确保您的成功。


全细胞提取

核提取

核提取(无核酸)

组蛋白提取

染色质提取

申请

酶活性测定


蛋白检测

酶活性测定


蛋白检测

蛋白检测

组蛋白检测

染色质 IP


DNA-蛋白质结合试验


核酶测定

样本类型和数量


细胞数量:200 至 500 万

细胞数量:200 至 500 万

组织:可变

细胞数量:200 至 500 万

组织:可变

细胞数量:200 至 500 万

组织:10 mg

细胞数量:10 万至 1000 万

组织:50-200 mg

测定时间

≤ 45 分钟

≤ 60 分钟

≤ 60 分钟

≤ 60 分钟

≤ 60 分钟

产品代码

ab113475

ab113474

ab113477

ab113476

ab117152

表1:染色质样本制备试剂盒

蛋白免疫印记法

例如,通过蛋白质免疫印迹法比较疾病与健康样本中的组蛋白 PTMs 可以揭示改变的转录程序和失调的基因。在这样的实验中,结果应该标准化为核对照抗体。

用 Abcam 组蛋白抗体成功进行蛋白免疫印迹试验的技巧:

  • 使用高百分比凝胶,可清楚地解析组蛋白。
  • 使用孔径为 0.2 μm 的硝酸纤维素膜,确保组蛋白的最佳捕获。
  • 在您的封闭液中使用高品质的 BSA,而不是像 Marvel 这样的传统奶粉。
  • 始终使用上样对照抗体来标准化您的实验。

您可以点击此处了解我们完整的组蛋白免疫印迹试验方案。

比色法和荧光法测定

组蛋白 PTM 也可以用比色法或荧光法测定,其利用基于 ELISA 的系统来快速准确地定量组蛋白修饰。Abcam 提供评估一般和特定组蛋白修饰的多种试剂盒,提供了一种快速简便的方法来扩展大样本队列的实验。

  • 96 孔板形式
  • 直接来自于贴壁或悬浮细胞样本,包含新鲜或冷冻组织
  • 与人、小鼠和其他哺乳动物种属相容

通过 ChIP 研究组蛋白修饰

染色质免疫沉淀 (ChIP) 是一种强大的技术,可更精确地检查整个基因组的组蛋白修饰。ChIP 使用抗体来分离蛋白质或目的修饰,以及它所结合的 DNA。然后对 DNA 进行测序,并将其定位到基因组,以确定蛋白质或修饰的位置,以及其在该位点的丰度。

图 3: 组蛋白修饰 ChIP。​抗体直接结合到修饰的组蛋白尾部。免疫沉淀和 DNA 纯化可以分离和鉴定修饰所占据的基因组区域。

如果已知特定组蛋白修饰的功能,ChIP 就可以识别具有这种组蛋白修饰签名的特定基因和区域,并在整个基因组中发挥相应的功能。然后可以进一步检测这些基因和区域在目标生物学过程中的作用。例如,针对 H3K4me1 的 ChIP 将揭示整个基因组中活性增强子的位置和序列,指向目的基因和遗传程序。

或者,如果不知道组蛋白修饰的功能,ChIP 可以识别具有这一签名的序列、基因和位置,然后利用这些信息来推断修饰的功能。这种技术在解码许多组蛋白密码时是非常关键的,并且在确定新发现的修饰如泛素化和其他新标记的功能时仍然是可行的。Abcam 为组蛋白修饰提供快速简便的 ChIP 试剂盒,针对高质量、可重复的结果进行设计和优化,加速您的表观遗传学研究。

您可以点击此处了解我们为组蛋白修饰研究推荐的自然 ChIP 方案。

组蛋白修饰酶:写入器和擦除器

组蛋白修饰是通过特定的酶从组蛋白中动态添加和去除的。这些写入器和擦除器之间的平衡决定了哪些标记存在于组蛋白上,以及处于什么水平,最终控制特定的遗传程序及其编排的细胞过程处于开启还是关闭状态。一些主要类别包括:

修饰酶

写入器

擦除器

乙酰化

组蛋白乙酰转移酶 (HATs)

组蛋白去乙酰化酶 (HDAC)

甲基化

组蛋白甲基转移酶 (HMTs/KMTs) 和蛋白精氨酸甲基转移酶 (PRMTs)

赖氨酸脱甲基酶 (KDMs)

磷酸化

激酶类

磷酸酶类


关于组蛋白修饰的阅读器、写入器和擦除器的更多细节,请查看我们的表观遗传修饰的海报

检查组蛋白修饰途径对于确定表观遗传状态在基本生物学过程、疾病病理学以及药物发现的背景下如何被控制或出现功能障碍非常重要。识别修饰途径和起作用的特定写入器和擦除器可以揭示:

  • 相关的细胞通路、遗传程序和生理效应有待进一步研究。例如,已知 HDACs 激活免疫发育途径,而组蛋白乙酰转移酶 (HATs) 在分化和增殖中发挥关键作用。
  • 写入器和擦除器之间的不平衡,改变了遗传编程和疾病过程的基础。从癌症到自身免疫性疾病,表征这些失衡和涉及的特定酶可以为疾病病理学提供重要见解。
  • 新的药物靶点和治疗策略。一旦发现失衡,就可以开发出药物来影响这些酶的活性并纠正失衡,为医学上至今难以攻克的疾病提供新的治疗策略。例如,许多 HDAC 抑制剂正在开发中,作为对抗癌症和炎症性疾病(如关节炎和 I 型糖尿病)的新型药物。

对于药物开发活动,化合物可以很容易地通过各种检测方法进行筛选,以影响写入器和擦除器的活性。


  • 表征组蛋白甲基化途径

一般来说,组蛋白甲基转移酶 (HMTs) 检测试剂盒的开发具有挑战性,并且由于检测试剂盒的设计,大多数检测试剂盒存在许多缺点。HMT 试验通常利用 3H-SAM 作为甲基供体,并测量 S-腺苷高半胱氨酸 (SAH),作为甲基化反应的一般副产物。但是,这需要:

  • 放射性物质的处理
  • 高灵敏度,以克服甲基供体 SAM 的低 kcat(周转通常 < 1 分钟-1)和 KM 值
  • 预先纯化酶/蛋白复合物,以评估特定 HMTs 的活性
  • Abcam HMT 活性检测克服了这些困难,采用检测特定甲基化产物的抗体评估特定 HMT 的活性,以提供:
  • 容易的比色或荧光检测,无放射性
  • 与核提取物或纯化蛋白的相容性(检测试剂对目标修饰具有特异性)
  • 3 小时内的数据

有关我们的组蛋白甲基化检测的更多信息,请点击此处查看。


表征脱甲基酶活性

组蛋白去甲基化酶活性测定通常测定甲醛(脱甲基的副产物)的形成。因此,它们易受洗涤剂、巯基和一系列离子的干扰。与甲基化检测类似,这些检测方法对任何去甲基化酶都没有特异性,只能用纯化的蛋白进行检测。

Abcam 的组蛋白去甲基化酶检测通过直接测量去甲基化产物的形成来规避这些问题,可提供:

  • 比基于甲醛的检测试剂更高的灵敏度(20-1000 倍)
  • 无硫醇、清洁剂或离子干扰的更准确的数据
  • 与核提取物或纯化蛋白的兼容性(得益于该检测试剂对目的修饰的特异性)
  • 测定广泛物种(包括哺乳动物细胞/组织、植物和细菌)的去甲基化酶活性
  • 具有简单比色或荧光读数的快速微孔板格式
  • 3 小时内的数据

表征组蛋白乙酰化通路​

Abcam 提供高性能的试剂盒来分析总体活性,以及 H4 特异性的 HAT 活性。这些检测测定 HAT 催化乙酰基从乙酰辅酶 a 供体转移到组蛋白肽的过程,该过程会生成乙酰化肽和 CoA-SH。然后通过比色法或荧光法测定 CoA-SH 副产物:

  • 比色法测定-CoA-SH 作为生成 NADH 的必需辅酶,与可溶性四唑染料反应生成可通过分光光度法检测的产物。
  • 该检测方法是动力学研究的理想选择,可连续检测。
  • 荧光测定法-CoA-SH 与显色剂和探针反应生成荧光检测的产物。

组蛋白去乙酰化酶活性的表征

根据功能和 DNA 序列相似性,HDAC 蛋白分为四大类(I 类、IIA 类、IIB 类、III 类、IV 类)。I 类、IIA 类和 IIB 类被视为“经典”HDAC,其活性被曲古抑菌素 A (TSA) 抑制,而 III 类是 NAD + 依赖性蛋白家族 (sirtuins-SIRTs),不受 TSA 影响。IV 类本身被视为非典型类,仅与其他类存在 DNA 序列相似性。

这些类别中的每一类都与不同的细胞程序相关,可以用各种荧光测定法进行单独测定。例如,SIRT 通常与癌症和神经系统疾病相关。检测 SIRT 活性,或识别影响 SIRT 活性的药物,可能促成这些疾病的新型诊断或治疗策略。

荧光测定使用乙酰化肽底物,其氨基端和羧基端有荧光基团和淬灭基团。底物一旦脱乙酰化,就会被肽酶裂解,荧光基团从淬灭剂中释放出来。随后荧光团荧光强度的增加与去乙酰化酶活性成正比。Abcam 提供各种试剂盒,用以评估特定和一般的 HDAC 活性:

• 一般试剂盒:I 类 HDAC 活性试剂盒

                        通用 SIRT 活性试剂盒

• 特定试剂盒:HDAC8 活性试剂盒

                         单个 SIRT 1、2、3 或 6 检测试剂盒

抑制写入器和擦除器​

为了探索组蛋白修饰的参与和生物学功能,利用小分子抑制这些修饰酶,然后评估下游后果可能起到一定的作用。因此,写入器和擦除器的抑制剂是理解表观遗传修饰途径作用的关键工具。在学术和行业背景下的临床前研究情况中,这些抑制剂对于“可成药”靶标的验证也至关重要。

点击此处了解更多关于我们的组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶抑制剂的范围。

组蛋白修饰直接(乙酰基团排斥带负电荷的 DNA,以产生开放的染色质构象)或通过称为效应物的蛋白质接头来调节染色质的物理性质及其相应的转录状态。效应蛋白识别并结合到特定的表观遗传标记,随后,招募分子机器来改变染色质结构。这些表观遗传写入器最终通过将组蛋白密码翻译成行动来决定组蛋白修饰的功能结果。

效应结构域识别特异性组蛋白修饰

效应蛋白通过效应结构域识别并结合到组蛋白修饰标记,称为模块,如下所列。

组蛋白结合或效应模块

已知组蛋白标记

染色质域

H3K4me2/3, H3K9me2/3, H3K27me2/3

Tudor 结构域

H3K4me3, H4K20me2

MBT 结构域

H3K4me1, H4K20me1/2, H1K26me1

WD40 重复序列蛋白

R2/H3K4me2

溴结构域

Kac

PHD 结构域

H3K4, H3K4me3, H3K9me3, K36me3

14-3-3

H3S10ph

BRCT 结构域

H2A.XS139


这些模块通过排列在模块结合口袋上的氨基酸识别特定的组蛋白修饰(即乙酰化与甲基化)。同时,该结合口袋外的残基(特别是 N + 2 和 N-2 位置上的残基)决定了对被修饰的组蛋白和氨基酸残基的特异性(即 H3K4 vs. H4K20)。

结合口袋内外残基的轻微变异允许识别相似但不同的表观遗传标记。例如,效应蛋白可区分单甲基化、双甲基化或三甲基化状态,但甲基结合模块结构略有不同。例如,tudor 结构域可能只结合二甲基化或三甲基化的赖氨酸,而 PHD 手指模块可能同时结合两者,或者只结合未修饰的赖氨酸。

一旦结合到特定的组蛋白修饰上,这些专门的效应蛋白就会招募分子机器根据组蛋白密码来重构染色质。效应蛋白能够通过效应结构域结构的细微差别精确识别特定组蛋白残基上的特定组蛋白修饰,然后与特定的染色质重塑蛋白和复合物结合,实现组蛋白代码的精确翻译。

多价性使组蛋白代码复杂化

多个组蛋白结合模块通常存在于同一蛋白和/或蛋白复合物中,能够识别组蛋白修饰的特定组合。这就允许存在更复杂的组蛋白密码,其中组蛋白修饰之间相互作用,而不是被孤立地解释。从本质上说,这使得组蛋白修饰的字母表形成了单词,可以用更复杂、更微妙的含义来解读。

组蛋白修饰的多价结合对于识别具有复合特异性和增强亲和力的离散标记模式同时实现多样且精确的下游作用非常重要。例如,单个表观遗传标记(如 H3K4me3)可能在一个环境中激活基因转录,但在另一个环境中对其进行抑制,具体取决于周围的标记。下表显示了不同组蛋白修饰组合的一些功能关联的例子。

组蛋白标记

染色质状态

H3K4me2/3 + H4K16ac

转录活性同源异型基因

H3K4me2/3 + H3K9/14/18/23ac

转录活性染色质

H3S10ph + H3K14ac

有丝分裂原刺激的转录

H3K4me3 + H3K27me3

二价结构域

H3K9me3 + H3K27me3 + 5mC

沉默位点

H3K27me3 + H2AK119ub1

沉默同源异型基因

H3K9me3 + H4K20me3 + 5mC

异染色质

H3K9me2/3 + H4K20me1+ H4K27me3 + 5mC

失活 X 染色体


表:共存组蛋白和 DNA 修饰的功能关联

效应蛋白翻译不同组蛋白标记模式的能力反映在下面的模块连接面板中,该面板显示了人类蛋白质组中具有多个潜在组蛋白结合模块的蛋白数量 (http://smart.embl-heidelberg.de)。例如,8 个蛋白同时具有 Tudor 和 PHD 结构域,而 22 个蛋白具有溴和 PHD 结构域。这些多价蛋白的绝对数量及其效应结构域相互作用的多样性说明了如何以如此复杂和精确的方式翻译组蛋白代码。这种分析甚至不能说明蛋白复合物内不同效应蛋白之间的相互作用,因此组蛋白密码呈多样性和复杂性的可能性成倍增长。

一个蛋白或复合物中的多个效应模块可能在相同或整个组蛋白和/或核小体上与组蛋白修饰相互作用。这些相互作用可分类如下:

核内小体:与相同核小体结合

• 顺式组蛋白:与同一个组蛋白尾部结合

• 反式组蛋白:与不同的组蛋白尾部结合。

核间小体:与不同核小体结合

• 相邻桥接:与相邻核小体结合

• 不连续桥接:与非相邻核小体结合


3. DNA 结合蛋白:通过 ChIP 研究表观遗传学

染色质免疫沉淀 (Chromatin immunoprecipitation,ChIP) 是一项强大的技术,研究人员可以在其自然背景下检测表观遗传调控因子与 DNA 之间的相互作用。利用 ChIP,研究人员可在整个基因组内识别目的蛋白结合的特定基因和序列,为其调控功能和机制提供关键线索。通过解析蛋白质-DNA 相互作用的时间和空间动态,ChIP 提供了对核心生物学过程和疾病病理学的见解。

ChIP 用途极其广泛,适用范围极广。从检查详细的序列特异性蛋白结合到整体调控过程,ChIP 为研究人员提供了整合发现的工具,以描绘复杂表观遗传调控系统的全面详图。

ChIP 的应用

ChIP 在阐明基因调控、转录机器和染色质结构方面发挥了核心作用。下面是利用 ChIP 可以检测的一些关键蛋白。

转录因子。通过检测特定转录因子在基因组中的结合位置和时间,研究人员已经确定了特定的结合位点和序列,精确定位了下游基因激活,并揭示了关键转录因子的全基因组调控程序。

通过 ChIP 和其他方法进行的进一步研究,揭示了这些因子是疾病病理学背后的主要调控者,参与编排了导致癌症、自身免疫性疾病、过敏和许多其他疾病的表观遗传失调。通过识别这些主调控因子及其下游的遗传程序,ChIP 为针对多种疾病的诊断和治疗策略提供了新的靶标。

转录机制。ChIP 研究检测了 RNA 聚合酶 II 和其他转录组分、启动子或增强子复合物的结合,揭示了启动子和增强子序列以及转录调控的新机制。

染色质结构。在组蛋白密码的发现和表征中,ChIP 研究是可实施的。通过绘制特定组蛋白修饰的位置,并与已知的基因激活状态进行比较,研究人员已经记录了特定组蛋白残基上的乙酰化或甲基化如何影响基因激活或沉默以及染色质高级结构。这些组蛋白修饰特征现在可以通过 ChIP 来预测基因组特定区域表观遗传调控的这些方面。

随着新组蛋白修饰和染色质调控元件的发现,在基因组调控中,ChIP 仍然是揭示这些元件的功能及其相互作用复杂性的重要工具。

综合分析的力量。将多种蛋白质的 ChIP 分析结合起来,是描绘基因组调控全貌的有效方法。这一方法使研究人员能够研究不同类型的蛋白及蛋白复合物如何在空间和时间上在特定基因的特定位点或整个基因组相互作用,从而调控基因转录。

ChIP 拓展了您的表观遗传学研究的范围和精度

ChIP 有助于在多种尺度上分析表观遗传机制,具有无与伦比的精确性。研究人员通过 ChIP 可以检查:

局部表观遗传机制

  • 将在碱基对分辨率的目的蛋白定位到特定的目的基因或基因组区域
  • 识别目的蛋白的特异性结合位点序列

全基因组表观遗传编程

  • 将目的蛋白(如转录因子)定位于其在基因组中的所有结合位点​
  • 跨位点映射蛋白和染色质特征
  • 比较不同条件下某一蛋白/蛋白修饰(即组蛋白乙酰化)在不同位点的富集情况

动态表观遗传过程

  • 绘制单个启动子处每分钟的染色质变化
  • 在一段时间内定量可诱导基因的蛋白/蛋白修饰
  • 通过比较不同细胞状态、条件和时间点的 ChIP 结果,研究人员可以揭示表观遗传调控和失调参与目标生物学过程的本质机制。
  • 不同组织 — 揭示负责分化和细胞类型特定功能和特征的表观遗传程序和基因。
  • 不同的细胞周期状态 — 揭示负责细胞增殖和细胞周期控制的表观遗传程序和基因,对发育过程和癌症病理有影响。
  • 疾病与健康细胞 — 识别失调的关键基因和程序,揭示潜在的疾病病理和新的诊疗靶点
  • 治疗对比无治疗 — 揭示某些治疗或条件是否可能有效纠正作为疾病病理基础的表观遗传失调

方案概述:ChIP 如何工作

​​该 ChIP 程序利用抗体免疫沉淀目的蛋白,如转录因子,连同其相关的 DNA。然后回收相关 DNA,并通过 PCR、微阵列或测序进行分析,以确定基因组序列和蛋白结合位置。

程序可分为 5 个基本部分:

1.交联 2.破碎 3. 免疫沉淀 4. 反向交联和 5. 序列分析

图 4:ChIP 方案工作流程。逐步开展 ChIP 实验的方法

1. Cross-linking
In some cases, cross-linking of DNA and proteins may be required to stabilize their interactions, particularly for proteins that interact as part of large protein complexes and do not directly contact DNA. Crosslinking fixes these molecular interactions and freezes them at a particular point in time and is termed cross-linking ChIP (X-ChIP). In contrast, native ChIP (N-ChIP) which is performed without prior crosslinking.
Crosslinking is generally performed with formaldehyde, which reversibly crosslinks protein to DNA, RNA, and other proteins. Other chemicals like cisplatin can be used to selectively crosslink only between DNA and protein. Dual crosslinking with additional reagents may be required to study interactions between DNA and particularly large protein/RNA complexes.  UV crosslinking is irreversible and therefore not compatible with ChIP.

2. Chromatin Fragmentation
Chromatin must be fragmented into small pieces for efficient immunoprecipitation and precise mapping of the target antigen to the genome.  The size of the DNA fragments will ultimately determine the resolution of genomic mapping, so it is important to optimize the fragmentation protocol.
o N-ChIP provides the highest resolution mapping, with enzymatic digestion generating fragments the size of a single nucleosome at 175 base pairs. 
o X-ChIP relies on sonication to generate ideal fragment sizes of 200-1000 base pairs.
Steps 1 and 2 are incredibly important to optimize for each experiment to get the highest quality DNA possible for subsequent ChIP analysis. For more information on chromatin fragmentation and optimization, see section V.

3. Immunoprecipitation
The protein of interest, and DNA fragment to which it is bound, are then immunoprecipitated. The chromatin mixture is incubated with an antibody to the protein of interest, and either agarose or magnetic beads overnight at 4oC to form bead/antibody/protein/DNA complexes.  The beads are then collected by either centrifugation, for Protein A, Protein G, or Protein A/G agarose beads, or magnetic tube rack, for magnetic beads, to immunoprecipitate the antibody/protein/DNA complex.  Non-specific binding is removed with subsequent washes.

4. DNA Recovery and Purification
The antibody/protein/DNA complex is eluted from the beads with SDS and heat.  Crosslinking of protein and DNA must then be reversed with NaCl and heat for X-ChIP experiments. Any protein and RNA present are then degraded with proteinase K and RNase A, and the remaining DNA is purified with either phenolchloroform extraction or PCR purification kit.  

1. 交联

在某些情况下,可能需要 DNA 和蛋白质的交联来稳定其相互作用,特别是作为大蛋白复合物一部分相互作用的蛋白质,并且不直接接触 DNA。交联修复并在特定的时间点上冻结这些分子间的相互作用,,称为交联 ChIP  (X-ChIP)。相比之下,自然 ChIP  (N-ChIP) 无需预先交联。

交联一般用甲醛进行,甲醛可使蛋白质与 DNA、RNA 和其他蛋白质发生可逆性交联。其他化学物质,如顺铂,只能用于 DNA 和蛋白质之间的选择性交联。为了研究 DNA 和特别大的蛋白质/RNA 复合物之间的相互作用,可能需要用额外的试剂进行双重交联。UV 交联是不可逆的,因此与 ChIP 不兼容。


2.染色质断裂

染色质必须碎裂成小块,才能进行有效的免疫沉淀,并将靶抗原精确地定位到基因组上。DNA 片段的大小将最终决定基因组图谱的分辨率,因此优化片段化方案很重要。

  • N-ChIP 提供最高分辨率的图谱,酶消化产生 175 个碱基对的单个核小体大小的片段。
  • X-ChIP 依靠超声处理产生理想的片段大小,200-1000 个碱基对。

步骤 1 和步骤 2 对于优化各项实验以获得最高质量的 DNA 用于后续的 ChIP 分析是非常重要的。有关染色质断裂和优化的更多信息,请参见第五节。


3. 免疫沉淀

目的蛋白及其结合的 DNA 片段被免疫沉淀。染色质混合物与目的蛋白抗体一起孵育,琼脂糖或磁珠在 4℃ 条件下过夜,形成微珠/抗体/蛋白/DNA 复合物。然后通过离心收集蛋白 A、蛋白 G 或蛋白 A/G 琼脂糖珠,或磁珠的磁管架,以免疫沉淀抗体/蛋白/DNA 复合物。非特异性结合在随后的清洗中去除。

4. DNA 回收和纯化

通过 SDS 和加热,从微珠上洗脱抗体/蛋白质/DNA 复合物。接着必须通过氯化钠和加热逆转蛋白质和 DNA 的交联,用于 X-ChIP 实验。然后用蛋白酶 K 和 RNase A 降解存在的任何蛋白质和 RNA,剩余的 DNA 用酚氯仿抽提或 PCR 纯化试剂盒纯化。

您可以点击此处查看我们完整的 X-ChIP 方案,获取更多相关信息。

5. 分析 DNA​
接下来通过 qPCR、杂交阵列 (ChIP-on-ChIP) 或新一代测序 (ChIP-seq) 分析纯化的 DNA,以识别并定量已被免疫沉淀的序列。这些序列被映射到基因组,以确定目的蛋白结合的基因和区域。

​​样本制备:X-ChIP 与 N-ChIP

交联的目的是将目的抗原固定在其染色质结合位点上。组蛋白本身一般不需要交联,因为它们已经与 DNA 紧密相连。其他 DNA 或组蛋白亲和力较弱的 DNA 结合蛋白可能需要交联才能将其固定到位。

  • ChIP 用于组蛋白修饰时需要交联的可能性不大
  • DNA 结合复合物中所含的转录因子和蛋白等非组蛋白很可能需要交联
  • 距离目标相互作用的 DNA 越远,没有交联的 ChIP 效率就越低

染色质片段化差异

N-ChIP 和 X-ChIP 都需要染色质片段化来使相互作用容易被抗体接近,它们分别需要利用微球菌核酸酶或超声处理的不同片段化程序。

N-ChIP:对于 N-ChIP 实验,用微球菌核酸酶进行酶消化应该足以将您的样本分解成单个核小体(含有大约 175 个碱基对 DNA 的单体)。

• 纯化的单体不适合分析与某些染色质结合子的相互作用,如转录因子,这些转录因子通常与核小体间 DNA 结合。建议在这些情况下进行超声处理。

• 核小体是动态的,可能在酶消化过程中重排。这对于绘制基因组的某些区域可能是个问题,任何变化都应该用合适的对照品来监测(见定量 PCR 的检测对照品)。在没有交联的情况下,X-ChIP 应作为对照,用以评估任何动态的和不需要的变化。

• 酶切不会产生完全随机的染色质片段。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有利,但对 DNA 的消化不均匀或不相同。某些位点可能被过度表达,而其他位点可能不存在,这可能影响数据的准确性。

• 如何获得消化的一致性?购买后分装您的原液酶,并在每次设置实验时,使用新的等分试样运行新的时间进程。尽管在储存过程中酶的质量可能会随着时间的推移而发生变化,但染色质制备液中的变异风险(压实度等)要高得多;不应将一个染色质样本视为与之前所有其他样本相同的样本。

X-ChIP: 甲醛交联限制了微球菌核酸酶等酶对其靶标的接近,使得酶消化在 X-ChIP 实验中无效。取而代之的是通过超声处理产生 500-700 碱基对(2-3 个核小体)的随机 DNA 片段。

• 避免起泡,起泡会减少溶液内的能量转移,降低超声效率。超声处理也可能受到交联时间、细胞密度或细胞类型的影响。

• 虽然超声处理的染色质可以在液氮中快速冷冻并在 -80℃ 下保存长达 2 个月,但要避免多次冻融循环。

• 尽管超声处理理论上并未表现出对基因组的优先切割,但实际上很少如此。

• DNA 片段大小通常较大,影响检测的分辨率。无论如何,对于 ChIP 中的大多数用途,高达 1.5 kb 的片段都能很好地分辨。微球菌核酸酶消化可结合超声处理提高分辨率,对于温和或不完整的交联样本可能有用。

无论选择哪种片段化方法,在设置实验时,始终运行片段化时间进程以优化片段大小很重要。

在选择 N-ChIP 和 X-ChIP时需要帮助?查看下方快速汇总表,了解这两种方法的关键优缺点。





​​


N-ChIP

X-ChIP


优势

高效沉淀 DNA 和组蛋白

针对非组蛋白。可对所有细胞类型、组织和生物体进行检测。


结合的特异性的可预测性更高

实现 DNA-蛋白质、RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质交联


高分辨率(约 175 bp/单核小体)

减少染色质重排的机会


缺点

仅针对组蛋白

过度固定可防止有效超声处理


选择性核酸酶消化可能会偏倚输入染色质

甲醛可改变抗原的结合特性


高浓度的核酸酶可能过度消化染色质

与 N- ChIP 相比,分辨率较低




表:N-ChIP 相对 X-ChIP 的优缺点。

抗体选择

并不是所有的抗体都适合 ChIP 实验,而且很多抗体不在 ChIP 质量等级或未经过 ChIP 应用验证。选择合适的、ChIP 级抗体对您成功地进行 ChIP 实验而言至关重要。

如果没有市售抗体,或者您想尝试一种尚未进行 ChIP 检测的抗体:

• 批准用于 IP、IHC 或 ICC 应用的抗体是很好的选择。类似于 ChIP,这些应用可识别蛋白的天然构象,与蛋白质免疫印迹抗体相反,后者可能只识别变性的肽形式。

• 抗体特异性是一个主要的关注点,在应用于 ChIP 实验前应充分表征。对于 N-ChIP 应用,在蛋白质免疫印迹中使用多肽竞争。然而,对于 X-ChIP 应用,这种方法将不能保证抗体功能,因为交联可以极大程度地改变表位。相反,使用该抗体比较 ChIP 和蛋白质免疫印迹结果,以确认性能等同。

• 理想情况下,ChIP 的抗体应该经过亲和纯化;然而,许多实验室使用血清作为其抗体来源,然后克服严格缓冲液可能出现的背景问题。

对照品

ChIP 方案和数据分析可能很复杂,因此纳入正确的对照品以确保实验正常进行是非常关键的。

样本对照品

在所有 DNA 回收步骤中纳入输入样本对照品(尚未进行免疫沉淀),以便与下拉式样本结果进行比较,这一点至关重要。这种比较最终会使数据标准化,以提供可解释的结果。

对组蛋白修饰进行免疫共沉淀时,纯化的组蛋白 H3 和 H1 可以作为组蛋白制备质量的阳性对照品(组蛋白 H1 常用于 X-ChIP)。同时,小牛胸腺组蛋白作为阳性对照品用于检测蛋白质免疫印迹中抗体特异性。

抗体对照品

各种抗体对照品对于确保免疫沉淀成功和排除污染的可能性非常重要。下面是一些关键对照品的例子。

  • 活性基因位点的阳性对照品:H3K4me3 和 H3K9ac
  • 沉默基因位点的阴性对照品:H3K9me3、H3K9me 和 H3K27me3
  • 抗 GFP 抗体等非染色质表位的阴性对照品
  • 阴性 IP 对照品与同型 IgG 抗体对照品或仅微珠 IP

染色质重塑也可能会移动或移除特定位点的组蛋白(例如活性启动子)。为了证实核小体保留在特定基因组位点,使用针对非修饰组蛋白(如组蛋白 H3)的对照抗体。分析组蛋白修饰时,用抗 H3 抗体标准化为组蛋白含量。

定量 PCR 对照品

如果通过 qPCR 分析数据,则需要额外的对照品,以确保数据分析的质量。基因组的某些区域会比其他区域纯化得更好,一些核小体在酶促断裂过程中可能发生重排。因此,重要的是在起始物料以及纯化/ChIPed 材料的几个区域生成 PCR 引物,作为虚假结果的对照品。裂解起始细胞,制备起始物料,并取样用于与 ChIP 平行的控制区的简单 PCR。

此外,在 qPCR 阶段,重要的是对您知道应该或不应该结合目的蛋白的基因组位点进行阳性和阴性对照 qPCR。还必须进行非模板对照 qPCR,作为阴性对照,以确保 PCR 中没有污染。

方案优化

ChIP 方案必须在多个阶段进行优化才能达到最佳效果。您需要继续对若干步骤进行一些额外优化,才能获得最好的 ChIP 实验结果。

交联(仅 X-ChIP)。甲醛推荐用于可逆交联。甲醛是一种高效的 DNA-蛋白质交联剂,但不是一种有效的蛋白质-蛋白质交联剂,因此难以对不与 DNA 直接结合的蛋白质进行 ChIP 分析。可选择的交联剂可用于不同分子间距离的交联。

交联程序对时间要求严格,通常只能持续几分钟。过度交联会产生几个问题,包括抗原可用性和超声效率降低。例如,抗原决定簇可能被掩盖或改变,从而减少抗体与抗原的结合以及随后从您的样本中提取物质。

始终通过时间进程实验(2 至 30 分钟交联)优化交联条件。

• 淬灭甲醛,终止与甘氨酸的交联反应。

• 蛋白质和 DNA 之间的交联被蛋白酶 K 破坏,蛋白酶 K 切断脂肪族和芳香族氨基酸羧基附近的肽键,进一步帮助 DNA 纯化。


染色质断裂。通过将染色质切割成适当大小来优化您的染色质输入至关重要。片段大小应小于 1kb,但最好为 200-1000 bp。MNase 酶切至单核小体水平(175 bp)可获得最佳分辨率。在 2 至 30 分钟内进行一次染色质消化的时间过程,纯化 DNA 并沿着 DNA 梯带运行凝胶,以确定达到最佳 DNA 片段大小的条件和时间(图 x)。不同的因素需要在 N-ChIP 和 X-ChIP 方案之间进行优化。​

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​​

图 5:超声时间进程实验示例。 超声处理 U2OS 细胞 5、10、15 和 20 分钟。交联反向,纯化的 DNA 在 1.5% 琼脂糖凝胶上溶解。片段大小在时间进程中减小。15 分钟时观察到最佳片段大小。​​

抗体浓度。抗体的效价对优化信噪比有重要意义。从每 25-35 mg 纯净单体 3-5 µg 抗体开始。对于定量 ChIP,您可能需要将染色质的量与等量的抗体进行匹配。ChIP 通常需要大量的一抗(每 ug 微珠需要 1-10 μg 一抗)。与许多技术一样,在运行实验前,必须在开始时优化抗体的量。

清洗缓冲液。确定冲洗步骤适当强度的正确组成,通常在 250-500 mM 氯化钠或氯化锂之间。盐和清洁剂的浓度越高,产生的结果越清洁。但是,必须在低背景和对目标的有害影响之间取得平衡。如果缓冲液过强,会破坏特异性抗体相互作用,导致信号偏低。如果缓冲液不够强,非特异性的相互作用将仍然存在,导致高背景。NP-40 可作为去污剂,而 RIPA 常用于 X-ChIP。

低细胞数的 ChIP

标准 ChIP 工作流程需要大量的细胞。约 106 至 107 个细胞作为起始物料,低于该细胞量时,由于高背景结合、低富集效率和富集文库复杂性丧失,检测会受到阻碍。但是,获得这么大的样本量很难,特别是在检查像转基因小鼠组织或临床样本这种珍贵的样本类型时。为了适应较低的样本输入,可以应用一些策略。

1.提高富集效率,最大限度地减少样本损失

对 ChIP 工作流程作出一些调整可以提高富集效率,并最大限度地减少低输入样本的样本损失。

• 着重考虑样本本身的质量和性质。具体来说,在福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本中,过度交联会产生问题。从 FFPE 样本中提取可溶性染色质的方法可能会有帮助。

• 可通过调节缓冲液 pH 值、离子强度和孵育时间等变量优化低浓度抗原免疫沉淀的动力学。

• 宽泛的 DNA 片段大小分布阻碍了低输入 ChIP 的分析,可通过限制更多的超声处理和/或 MNase 消化进行补救,以确保片段化更均匀。

• 虽然有时会使用细菌 DNA 作为一种封闭剂来降低标准 ChIP 的背景,但不建议将其用于低输入 ChIP,因为其可进行检测并干扰数据分析。其他封闭剂(如惰性蛋白)或 mRNA 可以减少低输入 ChIP 中的背景结合,而不污染数据。

• 将检测试剂小型化为微孔板格式有助于自动化,并在 IP 工作流程中提高抗原浓度(靶转录因子)- 这避免了低抗原浓度的“稀释效应”,有利于抗体:抗原复合物的解离,并降低了 ChIP 的效率。

• 最大限度地保留样本,采用单管分析格式,并在每个分析步骤后使用磁珠纯化而不是基于酚的提取。

• 抗体的固定和去除非抗体结合物质的洗涤液往往被忽视。标准方案使用蛋白 A/G,但像表位标签蛋白这样的替代品可能存在过度表达和引入伪迹的风险。

2.读出和下游数据处理平台

除了检测本身,下游处理(即测序、阵列或 PCR)和生物信息学分析的选择和优化也很重要。

• 检测平台影响检测灵敏度。ChIP 测序 (ChIP-seq) 是高灵敏度的金标准平台,其噪音始终低于 ChIP-on-chip。

• 低输入 ChIP-seq 实施过程中最常见的问题在于大量不可定位的读段、PCR 重复序列和较低的文库复杂性。因此,必须通过优化接头连接对低输入样本的文库制备进行优化,避免扩增产生的误差和偏倚。如上所述,最大限度地提高 ChIP 富集的效率也会有所帮助。

• 应调整生物信息学工作流程,以考虑数据中可能存在的工艺偏差。

组织 ChIP

​​检查特定组织中的表观遗传机制可以揭示组织特异性遗传编程、发育和生物过程的基本要素。ChIP 可作为检测组织特异性转录因子、基因活化和其他表观遗传调控方面的作用和机制的有价值的工具。执行来自组织样本的 ChIP,需要专门的染色质制备方案,以确保输入的材料质量和可靠的结果。

如欲了解更多信息,您可以点击此处查看我们来自组织样本的 ChIP 方案。

疑难解析

即使进行了优化,首次实验的结果也可能不尽完美。在此,您可以找到一些常见的问题及其相应的解决方案。

非特异性抗体对照品的高背景

潜在问题

解决方案

与微珠非特异性结合

增加额外清洗

或者

在免疫沉淀之前,将超声处理的染色质与蛋白 A/G 微珠孵育 1 小时,添加预清除步骤

微珠背景高

尝试不同品牌的微珠和不同的封闭策略,了解哪些微珠和测量在您的非特异性对照品中提供的背景最低

清洗缓冲液受污染

更换缓冲液


低信号

潜在问题

解决方案

细胞未有效裂解

RIPA 缓冲液应该有良好效果

起始物料不足

ChIP 通常需要大量的输入,每个 IP 条件下至少有 25 μg 染色质(3-4 万个细胞)

染色质片段可能太小

在凝胶上运行以确保正确的大小,必要时重复碎片优化

抗体不足

通常 3-5 μg 足够,但如果未观察到信号,则可能需要达到 10 μg

单克隆抗体可能不适合,特别是对于 X-ChIP,因为交联可能会掩盖表位

尝试多克隆抗体或 ChIP 级/获批单克隆抗体

洗涤缓冲液过强,消除了特异性抗体结合

缓冲液中的氯化钠不得超过 500 mM。清洗缓冲液应如上所述进行优化

错误的亲和微珠




如果不分析组蛋白,N-ChIP 可能不适合




如果使用 X-Chip,细胞可能交联时间过长,减少表位的可用性;或者过短,减少 DNA 从 IP 的下拉

确保抗体种类和免疫球蛋白与选择的微珠结合或使用蛋白/抗原混合物



分析 DNA 亲和力较弱的蛋白质可能需要 X-ChIP,以使蛋白质与 DNA 保持交联



此外,还需优化交联时间进程


注意:信号低可能是真实的,且目标区域没有抗体富集。

纳入阳性对照抗体和位点,以确认 ChIP 正在工作。抗原可能存在,但不在预期的基因组位点。

较大区域内具有低分辨率和高背景

潜在问题

解决方案

DNA 片段可能过大

片段大小应小于 1kb,但最好为 200-1000 bp。MNase 酶切至单核小体水平(175 bp)可获得最佳分辨率。在凝胶上运行,必要时进一步优化染色质断裂步骤。


PCR 扩增问题:

PCR 后所有样本中的高信号,包括非模板对照

潜在问题

解决方案

qPCR 溶液可能被污染

由贮备液制备新溶液

样本中无 DNA 扩增

潜在问题

解决方案

引物可能不起作用

纳入输入 DNA 对照品



还有哪些处理可能会影响我的 ChIP 结果?

一些抗体会受到浓度相对较低的 SDS 的影响。添加 TSA、丁酸盐或秋水仙胺一般不会影响 ChIP。

ChIP 读数

​​一旦下拉的 DNA 片段被免疫沉淀和纯化,可以通过许多不同的方法对其进行分析。

qPCR

利用基因或靶标特异性引物扩增下拉式 DNA 中已知的靶标位点

局限性:

  • 必须知道目标区域的基因组序列才能设计读出引物

ChIP-on-Chip

采用微阵列检查整个基因组内许多目标位点、特定结构域等的存在。扩增下拉样本和对照样本,并用互补荧光探针标记。合并样本并与目标微阵列杂交。荧光信号的比率表示目的蛋白已经结合的富集区域。

局限性:

  • 需要大量细胞
  • 对重复元素不敏感
  • 为覆盖整个基因组,必须使用大量的阵列
  • ChIP 操作后,易受扩增偏倚的影响
  • 分辨率低于 ChIP-seq

ChIP-seq

最常用的全基因组分析方法是提高碱基对分辨率,没有 ChIP-on-Chip 的局限性。扩增下拉 DNA 和对照样本,然后对片段进行高通量测序,再将其与基因组进行比对。重叠片段形成一个峰,表明目的蛋白与基因组结合的位置。

数据分析

应始终针对起始物料的量进行数据标准化,以消除样本量不均匀引起的误差。若要标准化数据,取最终扩增子值,并将其除以输入材料的扩增子值。对于组蛋白修饰,免疫沉淀的物料通常被标准化为相关的免疫沉淀组蛋白的输入量和数量。例如,带有 H3K4me3 抗体的 ChIP 将相对于输入量和 H3 免疫沉淀量表达。

测量起始物料的数量(和质量)是有效解释结果的关键。

使用在线软件进行 ChIP-seq 数据分析的教程

虽然 ChIP-seq 数据分析可能很复杂,但它可能是实验中最重要的部分。稳健的数据分析是获得准确可靠结果的关键。在线工具的组合使生物信息学专家和湿实验室生物学家都能访问数据解释。

本分步指南演示了如何从 ChIP-seq 数据中提取可靠的结果,以及如何解读成功 ChIP-seq 分析的数据集。如欲了解更多信息,请点击此处查看 Abcam 的数据分析网络研讨会。

本次网络研讨会涵盖了 ChIP 数据分析的以下步骤:

1.测序读数的 QC (FastQC)

2.读取对准/映射 (Galaxy/bowtie)

3.峰值调用 (Galaxy/macs)

4.结合信号可视化(UCSC 基因组浏览器)

5.从头开始的基序发现(模因 ChIP)

6.结合位点的基因本体论 (GREAT)

7.结合信号的热图表示 (seqMINER)


4. DNA 甲基化和去甲基化

在整个 DNA 中,许多化学修饰为 DNA 序列内编码的基因的表达增加了一层调控。这些化学修饰中,研究得最透彻的是 5-甲基胞嘧啶 (5mC),这种修饰被普遍视为基因表达的一种稳定的、抑制性的调节因子。人类基因组由大约 1% 的甲基化胞嘧啶组成,使其成为最丰富、最广泛的 DNA 修饰 (Moore et al 2012)。有几种方法可用于整个基因组的 5mC 测序,所有这些方法都有各自的优点和缺点,我们将在本指南后面讨论。这些方法包括全基因组重亚硫酸盐测序和抗体依赖性 DNA 免疫沉淀 (DIP) 或 MeDIP 等高分辨率方法。

最初发现 5mC 位于 CpG 岛内,是 CpG 二核苷酸富集的启动子区域中常见的 DNA 片段。正是在这些启动子区域内,5mC 作为一个稳定的表观遗传标记抑制基因转录。在哺乳动物基因组内,甲基化胞嘧啶最初在早期发育过程中通过从头甲基转移酶 DNMT3a 和 DNMT3b 整合到 DNA 中 (Okano et al 1999)。这些甲基化标记随后将通过一个额外的甲基转移酶 DNMT1 维持在整个基因组中,DNMT1 将在 DNA 复制过程中复制 DNA 甲基化模式到子链 (Vertino et al 1996)。

现今认为 5mC 是一个完全稳定的 DNA 修饰的想法不太具体。整个基因组中的许多甲基化胞嘧啶,特别是在基因体内,将经历一个被称为 DNA 去甲基化的过程。最终导致从 5mC 移回未修饰胞嘧啶 (C) 的过程。DNA 去甲基化能够通过以下任一种方式发生。被动 DNA 去甲基化;由于缺少甲基化维持酶,甲基化的胞嘧啶从基因组中被稀释。或活性 DNA 去甲基化;涉及 5mC 被 10-11 易位 (TET) 酶氧化为 5mC 的氧化衍生物(在 Wu et al 2017 中综述)。

活性 DNA 去甲基化发生在一个以 5mC 开始,以一个未修饰的 C 结束的循环中。5mC 最初氧化为 5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC),后者进一步氧化为 5-甲酰基胞嘧啶 (5fC),最后,再次氧化为 5-羧基胞嘧啶 (5caC)。然后通过胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶 (TDG) 结合碱基切除修复 (BER) 可以将 5fC 和 5caC 从 DNA 中去除,产生一个未修饰的 C。5hmC、5fC 和 5caC 一直是许多近期表观遗传学研究的焦点。关于这些表观遗传标记的发现越来越多,包括其具有稳定的表观遗传作用的潜力。为区分整个基因组中的这些标记,已经开发了许多测序方法,包括 MeDIP 上使用 5hmC、5fC 和 5caC 抗体的变异,以及重亚硫酸盐测序的变异,如 TET 辅助重亚硫酸盐测序 (TAB-seq) 。这些方法之间的差异稍后将在本指南进行讨论。

重亚硫酸盐测序

使用传统的 DNA 扩增方法检测 5mC 是不可能的,因为在样本制备和扩增过程中标记未得到维护。重亚硫酸盐转化是将 DNA 甲基化标记转化为适合扩增和下游分析的模板的最常用方法之一。重亚硫酸盐转化是利用 NaOH 和亚硫酸氢钠对 DNA 进行处理的化学反应,将胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶 (U),而甲基化的胞嘧啶则免于转化。

在 PCR 或测序等下游分析过程中,在重亚硫酸盐反应中发生脱氨基反应的非甲基化 C 碱基将被解释为胸腺嘧啶 (T),而 5-mC 碱基将保持不变,仍被测序输出检测为 C。这使您可以确定含有甲基化胞嘧啶的基因组的位置 (Frommer et al., 1992)

不完全转化。

重亚硫酸盐转化是一种非常有效的方法,其操作相对简单,并可以提供 DNA 甲基化状态的单碱基分辨率。不过,该方法确实存在一些弊端,研究人员应该考虑到这些方面。在导致 DNA 变性不足的次优反应条件下,或在反应完成前 DNA 链重新退火时,可发生不完全转化(或有时过度转化)。

区分 5hmC。DNA 降解通常是苛刻的重亚硫酸盐转化反应条件的副产物。这使得使用较小的样本具有挑战性。反应过程中,去磺化不充分将遗留可以抑制 PCR 中使用的 DNA 聚合酶的残留物。最近的证据表明重亚硫酸盐转化不能区分 5-mC 和 5-hmC。重亚硫酸盐转化将碱基数目从 4 个减少到 3 个,以此降低 DNA 序列的整体复杂性。试图将测序读段唯一地定位到参考基因组时,上述情况可能使基于 PCR 的下游询问的引物设计复杂化或引入挑战。

DNA 免疫沉淀 (DIP)

另一种常用于绘制 DNA 甲基化标记位置的方法是 DIP。DIP 在很大程度上依赖于拥有能够识别您的目标 DNA 修饰的抗体。但是,一旦您拥有这种抗体,DIP 将会是一种直接有效的方法。与需要进行全基因组测序的 WGBS 测序相比,这一技术价格更低,而且更容易分析。DIP 只需要对 IP 步骤中下拉的小剪切 DNA 区域进行测序。

迄今为止,DIP 已成功用于表征最充分的 DNA 修饰;5mC、5hmC、5fC 和 5caC (Pastor et al 2011,Shen et al 2013)。且已被用于一系列样本,包括胚胎干细胞 (Es)、脑组织和斑马鱼胚胎。该方法类似于 ChIP,但您的起始物料是不需要染色质的原始基因组 DNA。这种基因组 DNA 会被剪切到约 150-300 bp 大小,然后剪切后的 DNA 可以发生热变性。该步骤至关重要,因为抗体仅能够进入变性(开放)DNA 内的修饰。

DNA 变性后,剪切的 DNA 将与识别您的目标修饰的抗体一起孵育,通常孵育过夜,然后样本可以在一个 IP 步骤下将与抗体结合的所有 DNA 下拉,并洗去任何未结合的 DNA。我们建议此类 IP 步骤使用磁珠。当您进行 DIP 时,用 RNase 处理您的初始基因组 DNA 以去除样本中的任何 RNA 是很重要的。

基于 DIP 的应用程序

全基因组 DIP 分析:

DIP-测序

  • DIP 与 NGS 结合,绘制整个基因组的 DNA 修饰位置。
  • 由于物种之间这些化学结构具有保守性,研究人员很容易对其在任何有机体中选择的 DNA 修饰进行测序。
  • DIP-测序的文库制备和分析与 ChIP-测序非常相似。
  • 在您的 IP 中下拉的小 DNA 片段用于文库制备,与 WGBS 相比,这些片段可以在相对较低的读取深度进行测序,因为您对您的序列的选择性更大,即只有与您的抗体结合的区域。

靶标 DIP 分析:

  • DIP-PCR
  • 您从 IP 中获得的下拉 DNA,如上文 DIP-测序部分所述。不过,这次不需要使用剪切后的 DNA 进行文库制备,您可以在 qPCR 中将其作为模板 DNA。
  • 当您为该类型的 DNA 设计引物时,必须考虑到作为基因组 DNA 的模板会同时包含外显子和内含子。该方法可以非常有效地确定样本间的修饰水平。
  • 比较不同修饰的水平可能很棘手,因为包括抗体亲和力在内的许多因素都会对此产生影响。

DIP:技术考量

适当剪切您的样本。与 WGBS 不同,DIP 不是单碱基分辨率。您在剪切您的 DNA 样本时,注意须将这些 DNA 片段切割成 150-300 bp 大小,才能提高您的 DIP 测序的分辨率。拥有更大的片段意味着您不可避免地会在您的目标 DNA 修饰侧翼下拉更多的 DNA,而不是物理上与其绑定。这会导致您的测序分析中出现宽泛的非特异性峰。

获得良好的抗体。DIP 的另一个问题是,您需要有针对您的目标修饰的特异性抗体。您需要确保与其他类似修饰的交叉反应最小,例如如果您的 5fC 抗体也识别 5hmC,这对于绘制整个基因组中 5fC 的位置并不理想。用抗体进行这类测序也有很多优点。您仅受限于您可获得的抗体。如果您需要研究之前未在 DNA 中表征的修饰,例如 m6A(通常与 RNA 相关),您可以提供良好的 m6A 抗体。​
捕获 5hmC、5fC 和 5caC 的替代方法

传统的重亚硫酸盐测序最大的缺点是无法区分 5mC 的氧化衍生物,只剖出 5mC 本身。幸运的是,有许多关于重亚硫酸盐测序的变异和一些全新的方法来解决 5hmC、5fC 和 5caC 的测序问题。下面我们来详细地讨论其中的一些新方法。

5hmC 分布图

Tet 辅助重亚硫酸盐测序 (TAB-seq;Yu et al 2012)

  • 该方法依赖于 5hmC 到 5gmC 的转化。在该葡萄糖化反应中加入葡萄糖可保护 5hmC。
  • 然后向基因组 DNA 中加入 TET 酶,将所有存在的 5mC 和 5fC 转化为 5caC。亚硫酸氢盐转化后,将 5hmC 读作 C。
  • 5caC 和非甲基化的胞嘧啶均读取为 T。该方法给出了 5mC 和 5hmC 之间的明确区别。
  • 这种方法存在的问题是,所有到 T 的转换都会使生成的末端序列很难映射。它还需要非常深入的测序才能获得基因组的全覆盖,因此这可能比其他方法更加昂贵。

氧化重亚硫酸盐测序 (oxBS-seq;Booth et al 2012)

  • 这是在单碱基分辨率下检测 5hmC 的另一种方法。该方法使用过钌酸钾 (KruO4) 将 5hmC 化学转化为 5fC。
  • 转化后,所有 5mC 保持不变。随后的重亚硫酸盐处理和测序可通过比较 KRuO4 处理和未处理样本区分 5mC 和 5hmC 位点。

hMe-Seal. (Song et al 2011)

  • 与 TAB-seq 相似,hMe-Seal 从 5hmC 葡萄糖基化为 5gmC 开始。
  • 然而,在本方法中,添加的葡萄糖分子改造后含有叠氮基团,可以用生物素进行化学修饰。
  • 然后,5hmC 可以利用生物素和链霉亲和素之间的紧密结合在基因组内富集,从而进行 5hmC 的下拉。

核酸外切酶选择性化学标记 (SCL-exo;Sérandour et al 2016)

  • 该步骤的初始步骤与 hMe-Seal 相同,即 5hmC 的叠氮-葡萄糖糖基化。
  • 与生物素的叠氮化物反应允许存在的 5hmC 与链霉亲和素连接,但是,在该方法中捕获的 DNA 进行核酸外切酶消化,将在生物素-5gmC 处停止。

5fC/5caC 映射

M.SssI 甲基化酶辅助的重亚硫酸盐测序 (MAB-seq;Wu et al 2014)

  • 该方法可以在单碱基分辨率下定量测量 5fC 和 5caC。这一点将利用您 DNA 上的 M.SssI 甲基转移酶将所有未修饰的胞嘧啶转化为 5mC 来实现。
  • 亚硫酸氢盐处理后,所有新修饰的 C’s、5mC 和 5hmC 将在测序中读取为 C,但基因组中所有的 5fC 和 5caC 将读取为 T。
  • 如果将其与未进行 M.SssI 处理的测序进行比较,您可以确定 5fC 和 5caC 修饰在基因组中的位置。
  • 这种方法存在的最大问题在于不能区分 5fC 和 5caC。

5fC 化学辅助重亚硫酸盐测序 (fCAB-seq;Song et al 2013)

  • 该技术依赖于使用 O-乙基羟胺 (EtONH2) 对 5fC 进行的化学保护。
  • 这种保护作用阻止了亚硫酸氢盐介导的 5fC 的脱氨作用,因此在测序结果中以 C 的形式出现(与 5mC 和 5hmC 相同)。
  • 将其与未使用 EtONH2 处理的样本(其中所有 5fC 修饰将读取为 T)进行比较时,您可以区分基因组中具有 5fC 的所有位点。

5caC 化学辅助重亚硫酸盐测序 (caCAB-seq;Lu et al 2013)

  • caCAB-seq 利用 1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基] 碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 对基因组内的 5caC 进行修饰,催化 5caC 形成酰胺键。
  • 此化学修饰可防止重亚硫酸盐转化后 5caC 发生脱氨基反应,使其在测序中与 5fC 区分开来。

具有化学标记功能的 C 到 T 转换测序 (CLEVER-seq;Zhu et al 2017)

  • CLEVER-seq 不仅是单碱基分辨率,还可以在单细胞上使用。此方法只用于测序 5fC 分布,而不是 5caC。
  • 该方法使用丙二腈选择性地标记 5fC,生成 5fC-M 加合物,在测序中读取为 T。

DNA 修饰测序方法比较

选择适合您需要的最佳 DNA 修饰检测方法很重要。如果您需要能够量化修饰的绝对水平,您需要考虑您是否需要单碱基分辨率,以及在您的模型系统或样本类型中使用该方法的可行性。请查看我们在下方提供的表格,该表格总结出 5hmC、5fC 和 5caC 测序的一些可用方法的这些关键特征。

名称

说明

单碱基分辨率?

是否允许对修饰进行绝对定量?

参考文献

5hmC 分布

5hmC-DIP

用 5hmC 特异性抗体富集为 5hmC。

Pastor, W. A. et al Nature 2011

TAB-seq

5hmC 转化为 5gmC 来对其进行保护。5mC 通过 TET 酶转化为 5caC。亚硫酸氢盐转化后,5hmC 被读取为 C.5mC,5caC 被读取为 T。

Yu, M. et alCell, 2012

oxBS-seq

使用 KRuO4 以化学方式将 5hmC 转化为 5fC,可在单一浓度下区分 5mC 和 5hmC

Booth, M. J. et al Science, 2012

hMe-Seal

5hmC 与含叠氮化物的葡萄糖分子和生物素的葡萄糖基化允许使用生物素/链霉亲和素下拉富集 5hmC。

Song, C. X. et al.Nature Biotechnology 2011

SCL-exo

5hmC 的叠氮-葡萄糖糖基化及后续生物素反应,使得核酸内切酶活性在生物素 -5gmCs 处停止。

Sérandour, A. A. et al.Genome Biology 2016

5fC 5caC 映射

5fC/5caC DIP

使用 5fC 和 5caC 特异性抗体富集这些标记。

Shen, L. et al.Cell 2013

MAB-seq

M.SssI 处理 DNA,将所有 C 转化为 5mC。然后,重亚硫酸盐转换将导致所有 C、5mC 和 5hmC 被读取为 C。所有 5fC 和 5caC 被读取为 T。

Wu, H., Nature Biotechnology 2014

fCAB-seq

EtONH2 保护基因组中的所有 5fC 免受亚硫酸氢盐处理后的氧化。

Song, X. et al.Cell 2013

caCAB-seq

EDC 用于催化酰胺键形成 5caC,防止 5caC 在重亚硫酸盐转化时脱氨。

Lu, X. et al.JACS 2013

CLEVER-seq

丙二腈选择性标记 5fC,生成 5fC-M 加合物,在测序中被读取为 T。

Zhu, C. et al.Cell Stem Cell 2017


表:DNA 修饰测序法

液相色谱串联质谱法 (LC/MS-MS)

如果您可以使用 LC-MS/MS,那么 LC-MS/MS 将是量化总基因组 DNA 中 DNA 修饰量的最佳方法(Le et al 2011 和 Fernandez et al 2018)。使用绝对定量方法,LC-MS/MS 可对任何生物体和细胞类型的总 DNA 中发现的所有 DNA 修饰进行平行定量 (Zhang et al 2012)。对于绝对定量,您只受到以下限制,即您有哪些同位素标准品可作测量您的样本的标准品。

使用该技术并结合 DIP (DIP-MS),您可以确定您的 DNA 修饰抗体是否与您的目标修饰结合,还可以查看其是否与任何其他非特异性修饰结合。如果您生成了 DIP 输入和下拉样本的 LC-MS/MS 数据,您应该可以在下拉样本中看到与输入相比您的目标修饰的富集。然后,您也可以使用这些相同的数据检查其他修饰,以查看您的样本中是否存在富集的其他物质,以检测非特异性抗体结合。目前正在开发的软件将可以帮助您进行这种类型的分析。

LC/MS-MS:技术考量

技术上的挑战。质谱设备非常昂贵且非常专业。机器本身需要大量的维护,且经常需要其自身的技术人员掌握一切运行情况。操作机器非常复杂,需要专门的培训,因此您自己可能很难获得这种类型的质谱数据。如果您无法购买自己的 LC/MS-MS 设备,可以考虑通过合作或有偿服务获得这些数据。

DNA 修饰 IHC/ICC

也可以进行 DNA 修饰的 IHC/ICC。对标准 IHC/ICC 方案进行一些简单添加,即可完成该操作。您需要考虑的最显著的差异是,如果 DNA 修饰位于双链 DNA 内,则针对 DNA 修饰的抗体不能访问并结合修饰。这意味着您将需要使 DNA 变性,让其成为单链且可被抗体访问。

实现这一点的最常用方法是用酸处理您的样本。通常是 4N 盐酸 (HCL),直接应用于 IHC/ICC 切片(Yamaguchi et al 2013 和 Kaefer et al 2016)。在您的方案中添加此步骤的最佳时间是在加入一抗之前。使用清洁剂(例如 PBS 0.1%Triton)对细胞或组织进行透化处理后,可清洗并加入 4N HCl 使 DNA 链变性。步骤完成后,彻底清洗酸,并用碱(例如,100 μM NaOH 的 PBS 溶液)中和酸很重要。酸洗并中和后,您可以继续您通常的 IHC/ICC 步骤并加入一抗。

进行 DNA 修饰的 IHC/ICC 时,您还应该警惕您的抗体可能识别 RNA 上非常相似的修饰(例如 DNA 上的 5mC 和 RNA 上的 m5C)。为避免此问题,您可以通过 RNase 步骤处理您的样本,以去除所有存在的 RNA。同样,应优化此步骤,因为将您的样本留在 RNase 中的时间过长也会对存在的 DNA 造成损伤。

DNA 修饰 IHC/ICC:技术考量

为您的酸处理步骤计时。

  • 在开始使用您的实验样本之前,优化酸处理步骤的浓度和时间至关重要。
  • 酸处理时间过长会破坏样本,但仍需要足够长时间的酸处理来使 DNA 完全变性。
  • 组织样本的酸处理时间比 ICC 所用细胞更长。您可以尝试从 10 分钟到 40 分钟不等的时间范围,然后查看您获得的信号。
  • ICC 最多只需要 5 至 10 分钟,但首先进行测试并正确优化很重要。

双重 IHC/ICC。

  • 考虑到酸处理步骤的影响,使用 DNA 修饰进行双重 IHC/ICC 可能比较困难。酸处理可能会使样本中存在的蛋白质变性或降解您的第二个一抗识别所需的抗原决定簇。
  • 如果您想进行这样的双重免疫,将需要仔细优化。尽量缩短样本在酸处理步骤中的时间,以减少对其他蛋白质的损伤。您也可以考虑按顺序执行一抗步骤。
  • 例如,在酸处理步骤和加入第二个一抗(例如 DNA 修饰抗体)之前,应用第一抗体并用甲醛基固定剂对此进行固定。

选择合适的 DNA 染色剂。

  • 您可能会发现,由于酸处理步骤,您无法使用标准 DNA 染色剂。例如,DAPI 与双链 DNA 中存在的腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基的识别能力可能不如后者。
  • 在大多数实验室中,碘化丙啶 (PI) 是常见的替代药物。PI 将识别双链和单链核苷酸链。
  • 这意味着 PI 也会提取您样本中的任何 RNA,因此要注意到这一点。您也可以找到许多市售的 DNA 染色剂,这些染色剂将识别单链 DNA。

甲基结合域 (MBD) 蛋白

5mC 及其氧化衍生物在 DNA 去甲基化后对基因沉默和促进基因表达起重要作用。现在已经知道,其中一些 DNA 修饰可以作为标记,将蛋白质招募到特定的 DNA 位点,改变基因表达,充当表观遗传标记。除 5mC 外,MBD3 和甲基 CpG 结合蛋白 2 (MECP2) 还能结合 5hmC。一旦与 5hmC 结合,它们就会在 DNA 可及性和转录激活中发挥作用(Yildirim et al 2011 和 Mellén et al 2012)。

筛选 DNA 修饰的结合子的常用方法是使用下拉技术,然后使用质谱来筛选任何被下拉的蛋白质。该方法已成功用于发现 5mC、5hmC 和 5fC 的结合子(Iurlaro et al 2013 和 Sprujit et al 2013)。对于这个实验,您需要创建一个合成 DNA 诱饵,包含您感兴趣的修饰以及包含其他修饰和未修饰的胞嘧啶的诱饵,作为对照。这种 DNA 诱饵应与一端的生物素分子相连,生物素分子可用来将诱饵系在链霉亲和素连接的磁珠上。然后可以将您的目标样本中的蛋白提取物添加到栓系的诱饵中,并通过各种洗涤步骤冲洗掉任何非特异性结合的蛋白。之后,您可以洗脱剩余的蛋白质并进行质谱分析,以找出您的特定结合剂。

MBDs:技术考量

DNA 序列。

  • 当您设计合成 DNA 序列时,您可能需要考虑序列本身可能会影响您下拉哪些结合子。
  • 您脑海中可能有一个想用作诱饵的序列,比如您的目标基因的启动子区域。
  • 您的实验中有多种序列将有助于确保修饰作为关键因素,而不是 DNA 序列。

修饰次数。

  • 您序列中的 DNA 修饰数量也可能影响与您的诱饵结合的蛋白质。
  • 您应该考虑在一个序列中只进行一次修饰或多次修饰,以了解其对结果的影响。

洗涤。

  • 如果您想确保与您的诱饵结合的蛋白是修饰的真正结合子,进行非常严格的洗涤很重要。
  • 您可以尝试高盐清洗,以确保您清除所有非特异性结合的物质。您还面临着删除所有内容的风险,因此需要优化此步骤以获得最佳结果。

新型 DNA 修饰

新型 DNA 修饰可能还会出现,只是还没有被发现。现已证实一些传统上被视为 RNA 修饰的修饰也可能存在于 DNA 内。举个恰当的例子,N6-腺嘌呤甲基化,即 RNA 中的 m6A 和 DNA 中的 6 mA。这种修饰是最著名和最丰富的 RNA 修饰之一,但现在已知它也存在于 DNA 内。针对这一点的最初研究之一是2016 年John Gurdon 的实验室进行的研究 (Koziol et al 2016)。他们发现 6 mA 存在于非洲爪蟾、小鼠和人类基因组中。他们利用抗 6 mA 的抗体进行了 DIP-seq,证实了这一点。

自这项研究以来,出现了更多关于 6 mA 存在于 DNA 内的主张。Gurdon 实验室发表论文后不久,有其他研究显示 6 mA 存在于斑马鱼和猪基因组 (Liu et al 2016)、经受环境压力后的小鼠大脑 (Yao et al 2017) 和拟南芥基因组 (Liang et al 2018) 内。2018 年的一项研究进一步发现了分别负责 6 mA 甲基化和去甲基化 N6AMT1 和 ALKBH1 的酶 (Xiao et al 2018)。积极添加和删除 DNA 修饰的酶的存在表明了酶有着真正的目的,并可能有自身的表观遗传学功能。

新型 DNA 修饰:技术考量

抗体可用性。

  • 在单碱基分辨率方法可用于单个修饰之前,许多研究在很大程度上依赖于使用基于抗体的下拉 (DIP-seq) 来寻找 DNA 内的新型修饰。
  • 这里最大的问题是,您需要依赖一种特异性的市售抗体来进行修饰,而情况通常并非如此。许多 RNA 修饰抗体也会识别 DNA 内的修饰,因此这是您可以采取的一种方法。
  • 用 RNase 处理您的样本将有助于确保您的抗体只靶向 DNA。


5. RNA 修饰

表观遗传学领域正在衍生出许多令人兴奋的新分支。其中一条分支是 RNA 修饰研究领域。RNA 修饰检测和测序方法(例如 miCLIP)开发取得的最新进展意味着发现新的修饰并将其映射到任何细胞类型或模式生物中不同种类的 RNA 变得越来越容易和快速。这项技术的进步带来了已知 RNA 修饰数量的激增。目前,已知的 RNA 化学修饰超过 100 种。您可以在 mRNA、tRNAs、rRNAs 和包括 miRNAs 在内的其他非编码 RNAs 上发现这些修饰。这些修饰中的每一种修饰都有自己的功能,包括 RNA 结构、输出、稳定性和 mRNA 剪接。这一研究领域的前景非常光明;关于这些令人兴奋的新型修饰的功能还有待进一步发现。

图 7:RNA 修饰在 mRNA 和 tRNA 上的分布。点击此处,查看我们的 RNA 修饰海报,了解更多内容。

​​在所有的 RNA 物种中,tRNA 包含了最多的 RNA 修饰。tRNA 内几乎五分之一的核苷酸被认为含有 RNA 修饰。对 tRNA 的修饰是多种多样。一些修饰需要多个酶分步形成。通常,您可以在 tRNA 的反密码子环中找到修饰。在这里找到的修饰可以通过帮助密码子-反密码子相互作用和防止移码来提高翻译效率。

 RNA 修饰领域相对较新,但每天都在发展。我们知道,通过这些修饰进行工作可能会很棘手,但也正是基于这一点,我们在不断增加我们的 RNA 修饰范围,并提供新的方案和内容来帮助您进行研究。在本节中,我们将对其中的一些方案进行介绍,并提供一些与 RNA 修饰相关的技巧和建议。

RNA 修饰抗体

我们知道,采用 RNA 修饰进行工作可能很棘手,为此我们一直在增加我们的 RNA 修饰范围,以便在其他人之前获得用于最令人兴奋的新型修饰的试剂。我们也知道,获得真正对您选择的 RNA 修饰具有特异性的抗体很困难,因此我们使用多种应用来测试我们所有抗体的特异性。查看我们的 RNA 修饰抗体控制页面,了解有关如何检查您的抗体在模型系统中工作的详细信息。

您可以在此获得最适合您 RNA 修饰研究的试剂。我们的 m6A 抗体已经被几篇重要的出版物引用,包括一篇 Nature Methods 论文,该论文将其用于 m6A 的单碱基分辨率测序。同一 m6A 抗体还被一篇 Nature 论文引用,该论文描述了 m6A 在 mRNA 稳定性中的作用。如需了解我们的 RNA 修饰抗体的完整列表,请访问 www.abcam.com/RNAmods

RNA 修饰抗体:技术考量

抗体特异性和一致性。使用正确的对照品并在您的模型系统中检测抗体,确保您正在使用的抗体对您的目标修饰具有特异性,这一点非常重要。获得工作抗体后,您应该确保您仍会获得批间的特异性。重组 RabMAb® 技术通过在每轮抗体生产中使用相同的免疫原来消除批间差异。这样可以确保您在整个项目中获得一致的抗体和可重复的结果。我们的很多 RNA 修饰抗体都是 RabMAb® 单克隆抗体,包括 m6A、m1A、Mettl3、m2、2G 等关键靶点等等。

RNA 免疫沉淀 (RIP)

RIP 是一种基于抗体的技术,用于绘制体内 RNA-蛋白质相互作用的图谱。目标 RNA 结合蛋白 (RBP) 与其相关 RNA 一起免疫沉淀,以识别结合的转录本(mRNA、非编码 RNA 或病毒 RNA)。通过实时 PCR、微阵列或测序检测转录本。

近来,在表观遗传学和 RNA 生物学领域,人们对不同 RNA 作用和功能的兴趣激增。除转录和后续翻译之外,人们发现,RNA 的功能还有很多。例如,RNA-蛋白质相互作用能够调节 mRNA 和非编码 RNA 功能。这种对 RNA 潜力的新认识促进了新方法的开发,使研究人员能够绘制 RNA-蛋白质相互作用的图谱。RIP 就是这样一个允许研究单个蛋白质和 RNA 分子之间物理关联的方案。

点击此处,查看我们的完整 RIP 方案。

RIP:技术考量

RNase 污染。避免使用无 RNase 的枪头、试管和试剂瓶等无 RNase 的试剂造成污染;也可使用超纯的蒸馏、无 DNase、无 RNase 水制备缓冲液和溶液。

仔细规划您的对照品: 整个实验过程中应保持一个或多个阴性对照品,例如无抗体样本或来自基因敲除细胞或组织的免疫沉淀。不推荐使用敲除细胞进行阴性对照实验。​

下游分析: 可以使用几种技术分析从您的下拉列表中分离出来的 RNA。根据您要回答的问题选择最佳方法,并使用多种方法确认您的结果。例如,您使用 RIP-seq 获得的任何新的结果都应该使用 RIP-qPCR 进行确认。

CLIP

鉴于我们开始认识到 RNA 的作用不仅存在于转录、剪接和翻译等成熟的过程中,还存在于非编码 RNA 的 RNA 干扰和基因调控等更新的领域,人们对 RNA-蛋白质相互作用的兴趣日益高涨。

CLIP 是一种基于抗体的技术,用于研究与 RNA 免疫沉淀 (RIP) 相关的 RNA-蛋白相互作用,但与 RIP 的不同的是,CLIP 使用紫外线将 RNA 结合蛋白与结合这些蛋白的 RNA 交联。这种共价键是不可逆的,对纯化条件要求严格。与 RIP 不同,CLIP 提供了关于 RNA 上实际蛋白结合位点的信息。

CLIP 有不同的类型,高通量测序 CLIP (HITS-CLIP)、光活化核糖核苷增强 CLIP (PAR-CLIP) 和单个 CLIP (iCLIP)。

您可以在我们的完整 CLIP 方案中查看有关 iCLIP 方案的摘要信息(摘自 Konig 等人,J. Vis. Exp.2011 年)。点击此处,查看“iCLIP-蛋白质-RNA 相互作用的全转录组图谱与个体核苷酸分辨率”。

CLIP:技术考量

4-硫尿苷预孵育。4-硫尿苷预孵育和 UV-A 交联等可选步骤对某些蛋白质而言可能是必需的。4-硫尿苷可增强某些蛋白质的交联。详情见完整方案。

优化抗体浓度。开始实验前,可能需要优化所需的抗体量。无抗体样本是良好的阴性对照品。如果您在开始使用用于 IP 的抗体之前,尚未使用 CLIP 对您的目标靶标进行研究,说明该抗体在 CLIP 中可用。


miCLIP

来自康奈尔大学 Samie Jaffrey 实验室的一篇著名论文概述了真核生物 RNA 中 N6-甲基腺苷高分辨率定位的新方法,该方法被称为 m6A 个体-核苷酸-分辨率交联和免疫沉淀 (miCLIP)。

尽管 m6A 是真核生物 mRNA 中含量最丰富的修饰碱基,但目前准确研究这一方法仍存在局限性。绘制 m6A 高分辨率图谱的新方法对理解这种表观遗传 RNA 修饰而言至关重要。

miCLIP 可对整个 RNA 中的单个 m6A 残基和 m6A 簇进行高分辨率检测。利用 miCLIP,研究人员能够在人类和小鼠 mRNA 的单核苷酸分辨率上绘制 m6A 和相关二甲基化 m6Am(N6,2'-O-二甲基腺苷)的图谱。

此外,miCLIP 的开发为 m6Am 修饰(发生在 5’转录起始位点)提供了新的见解。促进了对 RNA 中这种知之甚少的独特表观遗传特征的功能的研究。

miCLIP 适用于较小的 RNA。该方案的作者发现 m6A 存在于小核仁 RNA (snoRNA) 中,snoRNA 是一类小型非编码 RNA。由于缺乏特异性和来自生物信息学的挑战,无法通过先前的应用确立这一点。

点击此处,查看我们完整的 miCLIP 方案。

miCLIP: 技术考量

并非 100% 精确。 该方法无法识别修饰残基的具体位置,只能确定 m6A 位点的大致位置​

生物信息学 m6A 调用中的偏倚。 数据分析使用基于已知共有序列的假设,这些序列含有 m6A 残基,因此这些基序以外的修饰缺失。​

液相色谱串联质谱法 (LC/MS-MS)

与 DNA 修饰类似,如果您可以获得 LC-MS/MS,那么 LC-MS/MS 将是量化总基因组 DNA 内 RNA 修饰量的最佳方式。此外,类似于测量 DNA 修饰,您可以使用绝对定量方法,仅受限于您可以用作您的样本测量标准品的同位素标准品。

 使用该技术并结合 RIP (RIP-MS),您可以确定您的 RNA 修饰抗体是否与您的目标修饰结合,还可以查看它是否与任何其他非特异性修饰结合。如果您生成了 RIP 输入和下拉样本的 LC-MS/MS 数据,您应该可以在下拉样本中看到您的目标修饰相对于输入的富集。然后,您也可以使用这些相同的数据检查其他修饰,以查看您的样本中是否存在富集的其他物质,从而检测非特异性抗体结合。

LC/MS-MS:技术考量
技术上的挑战。 质谱设备非常昂贵且非常专业。机器本身需要大量的维护,且经常需要其自身的技术人员掌握一切运行情况。操作机器非常复杂,需要专门的培训,因此您自己可能很难获得这种类型的质谱数据。如果您无法购买自己的 LC/MS-MS 设备,可以考虑通过合作或有偿服务获得这些数据。

RNA 修饰对照实验

您在使用 RNA 修饰抗体时,必须确保它们具有特异性 - 仅与正确的修饰结合。由于 RNA 修饰的性质,其化学结构通常极为相似。为了确保您从您的抗体中获得最准确的结果,您需要在您的模型系统中对其进行完全检测。RNA 修饰抗体的对照品可以使用一系列的应用来完成。为简化您的 RNA 修饰研究,请查看下方我们提供的一些高级对照品和提示。

RNase 处理

无论您正在进行 ICC/IHC 还是 RIP-qPCR,为您的实验样本准备一个经 RNAse 处理的对照品都至关重要。例如,如果您在您的实验 IHC 样本中看到一个清晰、明亮的信号,但在 RNAse 处理的对照样本中并未得到信号,您可以确信您得到的信号来自 RNA,而不是来自非特异性来源的背景信号。这表明抗体识别的是 RNA 内的修饰,而不是 DNA 内的修饰。

  • 使用 RNA 修饰抗体时,关键在于确保您没有从 DNA 中拾取高水平的非特异性背景信号。您可以在您的正常 RNA 修饰 IHC 或 RIP 方案中快速添加一个 RNase 处理步骤。重要的是不要让样本在 RNase 溶液中放置太久,这样会导致 DNA 降解,增加 DAPI 等复染的难度。
  • 对于每种不同的样本类型,您应该检测不同浓度的 RNase,并尝试在您的样本上保留不同的时间长度。例如,IHC 可能需要长达 1 小时的 RNAse 时间,具体取决于组织类型,而 ICC 需要的时间要少得多 — 尝试将 10-30 分钟作为起始点。

无论您正在进行 ICC/IHC 还是斑点印迹,都有必要在除您的实验样本 1 之外运行经 RNAse 处理的对照品,以确保您在使用 RNA 修饰抗体时不会从 DNA 中拾取非特异性背景信号。例如,如果您在您的实验 IHC 样本中看到一个清晰、明亮的信号,但在 RNAse 处理的对照样本中并未得到信号,您可以确信您得到的信号是来自 RNA,而不是来自非特异性来源的背景信号。这表明抗体识别的是 RNA 内的修饰,而不是 DNA 内的修饰。

您可以在您的正常 RNA 修饰 IHC、RIP 或斑点印迹方案中快速添加一个 RNase 处理步骤。

  • 重要的是不要将样本在 RNase 溶液中放置太久,这样会导致 DNA 的降解,增加 DAPI 等复染的难度。
  • 对于每种不同的样本类型,您应该检测不同浓度的 Rnase,并尝试在您的样本上保留不同的时间长度。例如,IHC 可能需要长达 1 小时的 RNAse 时间,具体取决于组织类型,而 ICC 需要的时间要少得多 — 尝试将 10 至 30 分钟作为起始点。

DNAse处理

除了 Rnase 处理的对照品,您还应该运行经 DNAse 处理的对照品。如果您担心您的 RNA 修饰抗体正在识别 DNA 内的一种类似修饰,最好用 DNAse 处理您的样本,对此进行检测。许多修饰都会同时存在于 RNA 和 DNA 内,所以这是一个常见问题。例如,DNA 内的 5mC 与 RNA 内的 m5C 具有相同的化学修饰。

  • 如果您使用 RNA 修饰抗体进行 IHC,那么最好在您的实验样本旁放置一个经 DNAse 处理的对照品。如果您从您的实验样本中得到了一个清晰、强烈的信号,但经 DNAse 处理的对照品没有信号,表明您的抗体正在与 DNA 内的一个修饰结合。
  • 对于这类对照品,优化条件也很重要。让您的样本在 DNAse 处理中停留太久会导致 RNA 降解,因此一定要检测不同的 DNAse 浓度和处理的持续时间。

竞争法检测

确保您的 RNA 修饰抗体特异性的另一个方法是使用竞争法检测。该检测使用的是含有合成修饰的寡核苷酸,可与您的抗体 2 一并预孵育。您在您的应用(例如 ICC/IHC 或斑点印迹)中使用这种预孵育抗体时,与单独使用抗体染色的样本比较后,您应该会看到获得的信号有所降低。您可以尝试将竞争寡核苷酸添加到您的抗体溶液中,并不断增加溶液浓度。您将看到信号的梯度逐渐降低,反映出您添加到抗体中的竞争物的量。例如,尝试按 0 ng、10 ng、100 ng 和 1µg 竞争寡核苷酸的梯度添加。

斑点印迹法 (Dot blot)

使用 RNA 修饰抗体进行斑点印迹法是检测其特异性的一个快速而简单的方法。斑点印迹法类似于简化版本的蛋白质印迹法。该技术的操作方法为,将样本直接点样到膜上,交联,然后进行印迹。更多详情,请在此查看我们的斑点印迹法。如果您有机会获得含有您目标修饰的合成 RNA 分子,可以将其作为最佳阳性对照品 2。同样,装载未修饰的分子或含有不同修饰的分子可以作为阴性对照品,并帮助您测量任何非特异性结合或交叉反应性。

  • 对于您的实验样本,可以通过正确的对照品运行斑点印迹法,以检测您的 RNA 修饰抗体是否具有特异性。对于阴性对照品,使用含有负责产生特异性 RNA 修饰的酶的敲除 (KO) 的样本,例如 m6A3,4 的 ALKBH5。
  • 如果您将野生型和 KO 样本的 RNA 加载到膜上运行斑点印迹法,您应该会看到两个样本之间存在明显差异。使用针对您的目标 RNA 修饰的抗体对膜进行染色时,野生型样本将显示清晰的信号,KO 应显示为空白。

RIP-MS

如果您可以获得液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS),那么 LC-MS/MS 将是检测 RNA 修饰抗体特异性的最佳方法 5。使用该技术并结合 RIP (RIP-MS),您可以确定您的抗体是否与您的目标修饰结合,还可以查看其是否与任何其他非特异性修饰结合。有关 RIP 的更多信息,请在此查看我们的 RIP 方案。或者查看我们的 miCLIP 方案,该方案已经过优化,适用于我们的 m6A 抗体 6。

  • 使用绝对或相对定量方法,您可以通过 LC-MS/MS 对在任何生物体和细胞类型的总 RNA 中发现的所有 RNA 修饰进行平行定量。如果您生成了 RIP 输入和下拉样本的 LC-MS/MS 数据,您应该可以在下拉样本中看到您的目标修饰相对于输入的富集。
  • 然后,您也可以使用这些相同的数据检查其他修饰,以查看您的样本中是否富集了其他物质,以检测非特异性抗体结合。目前正在开发的软件可以帮助您进行这种类型的分析。

使用成熟的抗体

大量 RNA 修饰(如 m6A)的分布在许多模型系统中得到了很好的表征。如果您的目标修饰不太为人所知,您可以使用诸如 m6A 的修饰作为许多应用的阳性对照品。例如,如果您正在进行 RIP-qPCR,并且想确保实验在技术上有效,您可以在您的实验样本旁对 m6A 进行 RIP-qPCR,并选择先前显示含有 m6A 的转录组区域作为阳性对照区域。这将有助于确保您的缓冲液、其他试剂和方法在您尝试进行新的修饰之前都能正常工作。





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