用于染色质免疫沉淀 (ChIP) 的组织染色质制备

该方案描述了如何从组织中制备随后可用于染色质免疫沉淀 (ChIP) 的染色质。

建议每个 ChIP/抗体使用 30 mg 肝组织。但是,对于其他组织,用量可能不同。组织的确切用量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。每次 ChIP 检测前,使用 5-15 µg 染色质优化方案。开始 X-ChIP 检测之前,应确定每种组织类型的确切染色质浓度。我们的交联染色质免疫沉淀 (X-ChIP) 方案应该在下面详细介绍的染色质制备后使用。使用的所有溶液中均应含有蛋白酶抑制剂,包括 PBS PMSF 10 µl/ml、抑肽酶 1 µl/ml 和亮肽素 1 µl/ml。


更多 ChIP 资源和产品

阅读本 ChIP 方案后,查看更多 ChIP 检测/染色质免疫沉淀资源和产品,或直接获得重要的 ChIP 数据:

- 经过仔细验证的 ChIP 抗体,包括重组兔单克隆抗体,旨在年复一年地提供完全相同的性能

- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152,用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质

- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500,或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒

本节摘自 Henriette O'Green、Luis G. Acevedo 和 Peggy JFarnham 友情提供的方案。


More resources and products for ChIP

After reading this ChIP protocol, review more ChIP assay resources and products, or go straight to getting great ChIP data with:

-  carefully validated ChIP antibodies, including recombinant rabbit monoclonals designed to give exactly the same performance year-after-year

- flexible Chromatin Extraction Kit ab117152 which is used to extract native, cross-linked, sheared or unsheared chromatin

- easy-to-use ChIP Kit ab500, or another kit from the ChIP kit product range.

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  1. 交联

    1. 冰冻组织应在冰上解冻。(该过程可能需要数小时,具体取决于组织量)。重要的是,冷冻组织样本不能达到高温,以防样本被蛋白酶降解。应始终将样本置于冰上,并快速执行所有步骤,以尽可能减少解冻。应在置于干冰上的皮氏培养皿中切割组织
    2. 用两个剃刀片(1-3 mm3 之间)将冷冻或新鲜组织切成小块
    3. 测定空的 15 mL 锥形管的重量,将组织移入管中再次称重,计算组织量
    4. 在通风柜中制备交联溶液。每克组织使用 10 mL PBS。加入甲醛,至终浓度为 1.5%,在室温下旋转试管 15 分钟
    5. 加入甘氨酸,至终浓度为 0.125 M,终止交联反应。室温下继续旋转试管 5 分钟。
    6. 将组织样本离心 5 分钟,720 rpm,4℃
    7. 吸取培养基,用 10 mL 冰冷的 PBS 清洗。离心 5 分钟,720 rpm,4℃,弃去清洗缓冲液
      * 此阶段可将组织在液氮中冷冻,并储存于 -70℃ 条件下。避免多次冻融。如果立即使用,将组织重悬在每克起始材料 10 mL 冷 PBS 中。置于冰上
  2. 组织降解

    1. Becton Dickinson 提供的 Medimachine 可用于制备单细胞混悬液。每克组织使用 2 份 medicone (50 μm) 进行处理
    2. 剪开 1 mL 移液器枪头,使管口变大
    3. 将 50-100 mg(3-4 块)组织重悬在 1 mL PBS 中
    4. 将此溶液加入 medicone 中,研磨组织 2 分钟
    5. 插入 18 G 钝针和 1 mL 注射器,从 medicone 收集细胞。在冰上从锥形管中收集细胞
    6. 重复步骤 2,直至处理完所有组织
    7. 用显微镜检查细胞混悬液,确保获得单细胞混悬液。如果需要额外研磨,向组织中加入更多 PBS,重复步骤 2.2 至 2.5,直至所有组织均被研磨成均质混悬液
    8. 将细胞离心 10 分钟,1000 rpm,4℃。测定/估计下一步的细胞团块体积
    9. 小心吸取上清液,用 FA 裂解缓冲液重悬团块(每 1 x 107 个细胞 750 μL)
    10. 从超声处理步骤开始,请继续执行 X-ChIP 方案

溶液

  • FA 裂解缓冲液
  • 50 mM HEPES-KOH pH 7.5
  • 140 mM 氯化钠
  • 1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) pH 8
  • 1% Triton X-100
  • 0.1% 脱氧胆酸钠
  • 0.1% SDS
  • 蛋白酶抑制剂(每次加入新鲜抑制剂)

摘自 Henriette O’Geen、Luis G. Acevedo 和 Peggy J. Farnham 友情提供的方案。



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