用于染色质免疫沉淀 (ChIP) 的组织染色质制备

该方案描述了如何从组织中制备随后可用于染色质免疫沉淀 (ChIP) 的染色质。

建议每个 ChIP/抗体使用 30 mg 肝组织。但是，对于其他组织，用量可能不同。组织的确切用量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。每次 ChIP 检测前，使用 5-15 µg 染色质优化方案。开始 X-ChIP 检测之前，应确定每种组织类型的确切染色质浓度。我们的交联染色质免疫沉淀 (X-ChIP) 方案应该在下面详细介绍的染色质制备后使用。使用的所有溶液中均应含有蛋白酶抑制剂，包括 PBS PMSF 10 µl/ml、抑肽酶 1 µl/ml 和亮肽素 1 µl/ml。

更多 ChIP 资源和产品

阅读本 ChIP 方案后，查看更多 ChIP 检测/染色质免疫沉淀资源和产品，或直接获得重要的 ChIP 数据：

- 经过仔细验证的 ChIP 抗体，包括重组兔单克隆抗体，旨在年复一年地提供完全相同的性能

- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152，用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质

- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500，或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒。

本节摘自 Henriette O'Green、Luis G. Acevedo 和 Peggy JFarnham 友情提供的方案。

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1. 交联

   1. 冰冻组织应在冰上解冻。（该过程可能需要数小时，具体取决于组织量）。重要的是，冷冻组织样本不能达到高温，以防样本被蛋白酶降解。应始终将样本置于冰上，并快速执行所有步骤，以尽可能减少解冻。应在置于干冰上的皮氏培养皿中切割组织
   2. 用两个剃刀片（1-3 mm3 之间）将冷冻或新鲜组织切成小块
   3. 测定空的 15 mL 锥形管的重量，将组织移入管中再次称重，计算组织量
   4. 在通风柜中制备交联溶液。每克组织使用 10 mL PBS。加入甲醛，至终浓度为 1.5%，在室温下旋转试管 15 分钟
   5. 加入甘氨酸，至终浓度为 0.125 M，终止交联反应。室温下继续旋转试管 5 分钟。
   6. 将组织样本离心 5 分钟，720 rpm，4℃
   7. 吸取培养基，用 10 mL 冰冷的 PBS 清洗。离心 5 分钟，720 rpm，4℃，弃去清洗缓冲液
      * 此阶段可将组织在液氮中冷冻，并储存于 -70℃ 条件下。避免多次冻融。如果立即使用，将组织重悬在每克起始材料 10 mL 冷 PBS 中。置于冰上

2. 组织降解

   1. Becton Dickinson 提供的 Medimachine 可用于制备单细胞混悬液。每克组织使用 2 份 medicone (50 μm) 进行处理
   2. 剪开 1 mL 移液器枪头，使管口变大
   3. 将 50-100 mg（3-4 块）组织重悬在 1 mL PBS 中
   4. 将此溶液加入 medicone 中，研磨组织 2 分钟
   5. 插入 18 G 钝针和 1 mL 注射器，从 medicone 收集细胞。在冰上从锥形管中收集细胞
   6. 重复步骤 2，直至处理完所有组织
   7. 用显微镜检查细胞混悬液，确保获得单细胞混悬液。如果需要额外研磨，向组织中加入更多 PBS，重复步骤 2.2 至 2.5，直至所有组织均被研磨成均质混悬液
   8. 将细胞离心 10 分钟，1000 rpm，4℃。测定/估计下一步的细胞团块体积
   9. 小心吸取上清液，用 FA 裂解缓冲液重悬团块（每 1 x 107 个细胞 750 μL）

   10. 从超声处理步骤开始，请继续执行 X-ChIP 方案。

溶液

• FA 裂解缓冲液
• 50 mM HEPES-KOH pH 7.5
• 140 mM 氯化钠
• 1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) pH 8
• 1% Triton X-100
• 0.1% 脱氧胆酸钠
• 0.1% SDS
• 蛋白酶抑制剂（每次加入新鲜抑制剂）

摘自 Henriette O’Geen、Luis G. Acevedo 和 Peggy J. Farnham 友情提供的方案。