ChIP 2.0:先进的染色质免疫沉淀技术指南

​​本指南概述了基于 ChIP 的最先进技术,并描述了这些技术的应用如何让人们对表观遗传机制产生新的认识。

染色质免疫沉淀(ChIP)是现代染色质分析技术的基础。ChIP 的中心法则是利用一种靶向目的蛋白或组蛋白修饰的抗体,下拉与之关联的 DNA 区域。ChIP 的适应性和多功能性使其能够用于解决各种研究问题。多功能性表现在两方面:抗体选择的多样性和技术的多样性(qPCR、微阵列、测序等)(Collas,2010)。

ChIP 与微阵列(ChIP-chip)的耦合是我们理解人类基因组的关键(Kim 等人,2005 年)。ChIP-seq 有助于 ENCODE 项目的开展,该项目绘制了更多的人类基因组(Landt 等人,2012 年)。此外,数据分析技术的创新为数据集的再分析或整合提供了可能(Klein 等人,2014 年)。这些操作可以发现新的、通常更可靠的信息。

传统的 ChIP 充当了一个跳板的角色,基于此开发出了新的应用类型,这些类型通常将 ChIP 与其他技术结合,以解决不同的生物学问题。交联染色质的限制性消化可实现相互作用片段的连接。这可以用来确定基因组的三维组织。ChIP 还可以与重亚硫酸盐转化等表观遗传学技术相结合,以探讨组蛋白修饰和 DNA 甲基化之间的相互作用。

点击下方链接,了解有关基于 ChIP 的最新技术的更多信息。

ChIP-loop

ChIP-loop 检测由特定目的蛋白介导的 DNA-DNA 相互作用。这一操作通过在相对标准的染色质构象捕获(3C)方案中加入免疫沉淀(IP)步骤来实现:

 细胞经甲醛交联后进行染色质分离和限制性消化。

 使用抗目的蛋白的抗体对交联的染色质进行免疫沉淀。

 连接粘性 DNA 片段末端,此时染色质片段仍与抗体结合,

 交联反转,DNA 纯化。然后利用 PCR 可以检测到目的特异性 DNA-DNA 相互作用,

结果证实,目的蛋白质介导了预测的 DNA-DNA 相互作用。

相较 ChIP 或 3C 而言,ChIP-loop 的主要优势为特异性。其一,相较简单的 3C 检测方法,通过 IP 去除大量的基因组 DNA 能够降低背景噪音。此外,通过对特定目标蛋白进行靶向分析,仅检测到特异性、生物学相关的相互作用。

也有观点认为,ChIP-loop 存在一项不足之处,其本身信息量可能并不大,应与 ChIP 数据相互参照。例如,如果与 ChIP-loop 相互作用的 DNA 在 ChIP 实验中没有同时富集,那么相互作用不应该被视为有效的相互作用(Simonis 等人,2007 年)。

2005 年,研究人员首次将 ChIP 和 3C 结合起来研究 Rhett 综合征的小鼠模型(Horike 等人,2005 年)。这些研究人员发现,沉默-染色质环的形成对于 Dlx50Dlx6 位点的功能非常重要。他们进一步发现,这一染色质环是由 MECP2 介导的,这种相互作用在 Rhett 综合征个体中丢失。

ChIP-loop 非常适合检测转录因子介导的 DNA 环,该转录因子是 Kcnq5 位点染色质环结构的主要调控因子。

ChIP-loop 提示和技巧

通过使用充足的起始原料,将连接偏倚降至最低。.在 DNA 浓缩于小体积时进行连接,染色质片段之间会发生不合需要的交叉连接。

如果可能,仅使用 ChIP 进行确认。 

如上所述,交叉参照 ChIP-loop 与 ChIP 数据,大大降低了 ChIP-loop 检测中的假阳性结果。

使用适当的对照品。

 建立含有等量连接产物的对照品模板。

 确定已知距离增加位点之间的相互作用频率,以估计随机相互作用。

 比较两种条件时,确定预期在两种状态下相同的区域的相互作用频率(类似于 Gapdh 或 ActB 如何用于基因表达分析)(Dekker,2006)。

ChIA-PET

通过末端配对标签测序法(ChIA-PET)进行的染色质相互作用分析是 ChIP 和 3C 技术的混合。ChIA-PEET 是 ChIP-loop 的高通量版本,能够通过整个基因组的目的蛋白检测长程染色质相互作用。方案的第一步与标准 ChIP 实验非常相似。

 使用甲醛交联细胞,连接整合的 DNA 区域和蛋白质。

 使用限制性内切酶消化染色质(或对染色质进行超声处理,参见提示和技巧),并用抗目的蛋白的抗体进行下拉。

 在连接过程中,加入连接序列,将 I 型限制性内切酶识别位点引入 DNA(Zhang 等人,2012年)。

 这些位点允许随后通过双端测序分离连接点。这样就创造了一个只有杂交的、相互作用的 DNA 片段的库。

 该库在下一代平台上测序,既可识别相互作用的区域,也可量化其相互作用的频率。

ChIA-PET 为研究人员提供了涉及目的蛋白的全基因组相互作用。

与同类技术相比,ChIA-PET 有许多优点。ChIP 的使用减少了待测序的 DNA 量,降低了复杂性,增加了测序反应的特异性。ChIA-PET 适用于所有基于标签的下一代平台(Roche 454 焦磷酸测序、SOLiD、Helicos 等)。如果有合适的抗体,ChIA-PET 可以用来检测任何蛋白质的相互作用。

与所有 ChIP 技术一样,ChIA-PET 也受到抗体特异性的限制。同样受限于已知的基因组,因为调用必须映射回参考基因组。最后,虽然 ChIA-PET 可以确定蛋白是否存在于相互作用的复合物中,但它不能确定该蛋白是否真正介导了相互作用。例如,该蛋白可能与另外两个自身结合 DNA 的蛋白相结合。

ChIA-PET 工作流程。 

摘自:Zhang 等人,Nature(2013 年 11 月)。

Fullwood 等人在 2009 年的一篇论文中引入了 ChIA-PET。这些研究人员开发了 ChIA-PET,用于绘制人类细胞中雌激素受体 α(ER-alpha)的结合位点。他们发现,ER-α 介导了基因启动子处长距离成环的形成,将基因聚在一起进行协调转录。

ChIA-PET 还被用于表征其他转录因子(如 CTCF)的结合动力学(Li 等人,2013 年)。Li 等人发现 CTCF 可能在组织最近确定的染色质拓扑结构域中发挥作用。Chen 等人(2013 年)使用 ChIA-PET 检测了 miRNA 调控,并发现 miRNA 的表达在大的染色质区域是协调的。

​​​ChIA-PET 提示和技巧

使用足量的起始原料。ChIP 步骤对于生成 ChIA-PET 库至关重要。至少需要 100 ng 的 ChIP DNA 才能生成足够复杂的 ChIA-PET 库。如果使用培养的细胞,至少使用 108 个细胞才能获得 100-300 ng 的 ChIP DNA(需要针对细胞类型和目的蛋白优化 IP)。

超声处理或限制性内切酶消化:慎重选择。超声处理避开了使用限制性内切酶缩短蛋白交联染色质的序列偏倚和局限性。同时提高了分辨率;然而,超声处理条件相当苛刻,并且可以导致长程相互作用损失。

如果您的实验依赖于长程相互作用,则可考虑限制性消化。如果存在序列偏倚和分离度问题,则可考虑采用超声处理。

分析非常复杂,需适应另一个 ChIP 程序,或使用以前开发的软件。开发 ChIA-PET 的同一研究团队提供了用于分析的软件(Li 等人,2010 年)。


ChIP-exo

对传统 ChIP 进行非常细微的修改就可以使 ChIP-exo 以单核苷酸分辨率检测蛋白结合。ChIP-exo 使用限制性酶切和新一代测序,以高分辨率确定全基因组蛋白结合。

首先将细胞甲醛交联,剪切并分离染色质。

 用抗目的 DNA 结合蛋白的抗体进行 IP,接着将接头连接到 DNA 片段上。

 然后用 λ 5’→3’ 外切酶消化 DNA。核酸外切酶去除蛋白质-DNA 复合物中突出的所有 5’ 末端 DNA,仅留下与蛋白质结合的 DNA 和 3’ 末端(Rhee 和 Pugh,2012a)。

 交联逆转,DNA 扩增,然后将另一个接头连接到 5’ 端。

 在新一代测序之后,可识别与第 2 个接头相邻的序列。这些序列是目的蛋白的结合位点。

与传统 ChIP 相比,ChIP-exo 有许多优点。最明显的是,ChIP-exo 的分辨率比几乎所有其他基于 ChIP 的技术都要高。实现的单核苷酸分辨率在许多不同的 DNA 结合蛋白中保持稳健(Rhee 和 Pugh,2011 年;Rhee 和 Pugh,2012a)。最重要的是,在实现高实验分辨率和规模的同时不会伴随出现类似技术所存在的缺点,特别是与全基因组方法相关的噪音。

ChIP-exo 工作流程。 

摘自:Rhee 和 Pugh,现行分子生物学方案(2012 年 10 月)。

DNA 消化步骤大大降低了噪音:所有非蛋白结合的 DNA 都被 λ 外切酶消化。还可以使用另外一种单链特异性核酸外切酶(如 RecJ)更有效地消化背景 DNA。这种 DNA 的去除大大降低了噪音,因此要求测序深度,并能降低成本。

另外一项主要优点是敏感性。与其他技术相比,ChIP-exo 可检测较弱的 DNA-蛋白质相互作用,从而发现更多生物学相关的相互作用(Rhee 和 Pugh,2011 年)。

ChIP-exo 唯一的实质性缺点与单个蛋白的多重结合事件有关。如果一个蛋白同时结合多个 DNA 位点,形成一个环或其他 3D 结构,则无法检测到这种结构;任何和所有多重结合事件都会丢失。ChIP-exo 仅仅读取这些事件中的单一结合事件。这个问题可能取决于蛋白质,因为复杂环状结构在转录中的意义越来越明显(Gibcus 和 Dekker,2013 年)。

Rhee 和 Pugh 在 2011 年的 Cell 论文中引用了 ChIP-exo 技术。这些研究人员检测了酵母转录因子 Reb1、Gal4、Phd1、Rap1 和人类 CTCF 的结合模式。他们发现,每个酵母转录因子都有多种结合模式和机制。例如,他们发现许多低亲和力位点具有高占位。这表明仅通过序列不能预测因子结合。成簇位点比孤立位点结合的因子更多这一发现在某种程度上对此进行了解释,表明包括高浓度和直接、间接合作在内的效应组合影响转录因子结合。在后续的一篇论文中,这些研究人员还使用 ChIP-exo 在被视为无 TATA 的启动子中识别了 TATA-box 样特征(Rhee 和 Pugh,2012b)。

ChIP-exo 提示和技巧​​

研究开始前评估分辨率是否至关重要。ChIP-exo 在几乎所有指标上都优于 ChIP-seq,但耗费人力和成本。如果额外的分辨率和更好的信噪比在您的实验中并非至关重要的部分,则可考虑采用 ChIP-seq 技术。

考虑使用磁珠。Serandour 等人 (参见补充阅读)修改了 Rhee 方案,以纳入磁珠的使用。与琼脂糖相比,磁珠能更好地下拉弱相互作用和大蛋白复合物。



ChIP-BS-seq and BisChIP-seq

ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 是两种几乎相同的技术,都用于结合 ChIP 和重亚硫酸盐测序。

重亚硫酸盐转化也许是可用的最丰富的 DNA 甲基化技术。亚硫酸氢钠用化学方法将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶,同时确保甲基化的胞嘧啶完好(Frommer 等人,1992 年)。重亚硫酸盐测序结合了重亚硫酸盐处理和新一代测序平台,在全基因组范围内提供单核苷酸甲基化分辨率。

结合 ChIP,5mC 信息可靶向携带特定组蛋白修饰或目标染色质结合蛋白的区域:

 ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 的第一步是针对目的蛋白或组蛋白修饰进行 ChIP。

 然后对样本进行尺寸选择和接头连接。连接顺序和类型以及大小选择方面存在微小差异。

 通过重亚硫酸盐处理库并在下一代平台上对库进行测序。

 使用生物信息学软件与参考序列进行比较后,获得了含有目标组蛋白修饰的区域的单核苷酸甲基化信息(Brinkman 等人,2012 年;Statham 等人,2012 年)。

表观遗传标记的共同出现对它们的功能而言至关重要,这一点愈发清晰。各种标记协同作用,以调节基因表达,并且通常彼此共同调节(Ernst 等人,2011 年)。因此,在相同的生物样本中检查两个或更多的表观遗传标记可以深化对研究问题的理解。这是 ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 的关键优势。

与传统的重亚硫酸盐测序相比,这两种技术还有另一个优势,那就是用于重亚硫酸盐测序的 DNA 减少。这意味着测序中需要的读数更少,大大降低了成本。但是,这确实也意味着需要大量的输入样本,因此 ChIP-BS-seq/BisChIP-seq 并不太适合低细胞计数的应用。

这些技术还有另一个缺点,即实验的特异性由抗体的质量决定,这一点与所有基于抗体的技术一样。

ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 由两个团队独立开发,发表在同一期的 Genome Research 上(Brinkman 等人,2012 年;Statham 等人,2012 年)。Brinkman 等人使用 ChIP-BS-seq 来观察组蛋白 H3 赖氨酸 27 三甲基化(H3K27me3)和 DNA 甲基化。他们发现 H3K27me3 和 DNA 甲基化在 CpG 岛是相互排斥的。Statham 等人使用 BisChIP-seq 检测了正常和癌变前列腺细胞中的 DNA 甲基化和 H3K27me3。令人惊讶的是,他们发现非甲基化和甲基化的 DNA 能够与 H3K27me3 区域相关联。这意味着 DNA 甲基化状态并不依赖于抑制性组蛋白标记的存在,这个假设被广泛接受。

​​ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 提示和技巧

数据分析可能非常复杂。由于这些技术相对较新,因此没有专为 ChIP-BS-seq/BisChIP-seq 数据设计的软件。Statham 等人发布了他们创建的自定义管道,点击此处可以查看。

调整参考序列,允许读取映射。将参考序列中的所有胞嘧啶替换为胸苷,以绘制转换后的重亚硫酸盐序列。



补充阅读​

  • Collas P (2010). The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol, 45, 87-100.

    这篇综述描述了 ChIP 的基本原理及其许多衍生技术,重点介绍了每种技术与基本方案的不同之处。

     Furey TS (2012). ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet, 13, 840-852.

    这篇综述重点介绍了 ChIP-seq 的原理,但也是其他相关技术的一个很好的资源。作者描述了每种技术的分析和数据输出差异。

     Splinter E, de Wit E, van de Werken HJ, Klous P and de Laat W (2012). Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods, 58, 221-230.

    这一章主要介绍了 3C 技术,还包括了 ChIP-loop 的基础和应用。

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    Sajan SA and Hawkins RD (2012). Methods for identifying higher-order chromatin structure. Annu Rev Genomics Hum Genet, 13, 59-82.

    这些文章涵盖各种 ChIP 和 3C 技术,包括 ChIP-loop 和 ChIA-PET。他们还研究了每种技术的优缺点,以及这些技术如何与染色质分析的大图相匹配。

     Serandour AA, Brown GD, Cohen JD and Carroll JS (2013). Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol, 14, R147.

    这篇论文描述了 ChIP-exo 在常见的 Illumina 测序平台上使用的适应性。ChIP-exo 的适应性在所有指标上都优于 Illumina 上的 ChIP-seq,并且是专门为人体实验设计的。

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    这篇初级论文利用 ChIP-BS-seq 探索了 H3K27me3 和 H3K4me3 在 TCGA 初级癌细胞中调控 CpG 岛 DNA 甲基化的作用。

    参考文献​​

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