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鉴于肿瘤和其他细胞类型存在异质性,研究人员继续寻求能够有效分析少量均质样本的实验技术。
2007 年,ChIP-seq 彻底改变了表观遗传分析,表现出巨大的优势,包括分辨率更高、基因组覆盖范围更广、伪影更少、单次相互作用的分析成本显著降低,但 ChIP-seq 需要大量的输入样本(约 1,000 万个细胞)(Barski 等人,2007 年)。
研究特定细胞类型、亚群或试图使用临床样本时,要想获得如此大量的材料是极具挑战的。幸运的是,ChIP 法、预扩增法和测序文库构建试剂经过多次改进,在样本量少的情况下成功运行的可能性大大增加。
如今,使用 100 万个细胞运行全面的 ChIP-seq 实验已相当普遍,但是团队继续增加技术极限,设法获得更好的性能。在此,我们讨论了几项最新进展,这些进展将继续减少 ChIP 测序研究的样本输入。
使用有限的细胞进行 ChIP-seq 是一项挑战,因为回收的免疫沉淀 DNA 的复杂性通常会降低,可能对灵敏度和重现性产生不利影响。
这就需要对免疫沉淀方法进行优化,使其适用于低输入设置。
使用更常见的甲醛交联染色质(X-ChIP)开发低细胞 ChIP-seq 方案的尝试工作已取得令人鼓舞的结果;基于标准 Illumina 文库制备程序,成功地使用 100 万人干细胞进行了 ChIP-seq(Hitchler 等人,2011 年)。
然而,虽然 X-ChIP 特别适用于研究弱结合转录因子或染色质相关蛋白,但涉及有限的样本材料时,交联过程使其效率大大降低。一些研究人员已经转而使用 Native ChIP(N-ChIP)方法来避免这些缺点。
与 X-ChIP 相比,N-ChIP 不需要交联,交联可以提供更好的分辨率并减少非特异性相互作用(O'Neil 等人,2003 年)。尝试使用少量细胞时,不需要交联可能会是一个重要优势。
最近,人们通过 ChIP-seq 将高度优化的 N-ChIP 方法应用到了全基因组分析上(Gilfillan 等人,2012 年),每次免疫沉淀(IP)使用 100,000 个细胞,并且得到了非常可靠的结果。以低输入为导向的 N-ChIP 对标准免疫沉淀方案进行了诸多调整。
其首先在浓缩 IP 缓冲液中稀释染色质,省去透析步骤,从而减少处理和样本损失。接着,使用 TPX 塑料器皿增加专门的超声处理步骤,最大限度地减少样本损失和污染,并确保碎片一致、无偏差。
然后,使用 Agilent 2100 生物分析仪监测随后的 Mnase 消化,以可视化微量。消化后,调整 Illumina 文库构建,基于大小选择捕获核小体大小的片段。最后,用 SPRI-微珠替换柱层净化,以便在各个步骤中更好地保留 DNA。
虽然优化的 N-ChIP 需要的细胞比其他一些方法要多,但它最大限度地减少了扩增的需要,在研究整个基因组中的组蛋白修饰时特别有用。
研究人员表示,通过提高免疫沉淀、DNA 纯化和测序文库构建方案的效率和稳健性,可能进一步增强分析性能。
一旦染色质免疫沉淀完成,实施优化的时机即成熟,在该过程的下一阶段对 ChIP 化材料进行扩增。用于为新一代测序制备 ChIP DNA 的标准文库制备方案涉及多个纯化和低效的酶促步骤,可能导致样本损失。
此外,ChIP 的样本回收率通常较低,特别是在进入 ChIP 反应的输入样本最少的情况下。因此,从 ChIP 反应中获得足够的材料用于随后的测序文库制备至关重要。
在此情况下,在文库构建之前可能需要样本扩增,以确保有足够的材料可用。在后续的 ChIP-seq 数据分析中,以下技术可以采取措施将核酸扩增中存在固有的偏差降到最小(Ponzielli 等人,2008 年),从而实现上述目的。
生成文库前,采用替代的、基于扩增的策略部署线性扩增或引物延伸,然后进行 PCR;优化后的技术已经能够极大地降低 ChIP-seq 的输入细胞需求,仅需要 5,000-10,000 个细胞。(Adli 等人,2010 年和 Shankaranarayanan 等人,2011 年):
Nano-ChIP-seq(Adli 等人,2010 年)是一种扩增方法,专门用于罕见细胞类型。Nano-ChIP-seq 从少至 10,000 个细胞中创建 ChIP-seq 文库需要三步。首先,使用随机发夹引物,然后通过核酸外切酶消化步骤从初始量很少的 ChIP DNA 生成扩增的样本。
此过程还可以最大限度地减少非特异性产品。接下来,使用优化的添加剂、循环条件和 PCR 酶实现 ChIP DNA 的高保真扩增,保持 GC 富集序列的正确表达。
最后,扩增的 DNA 在位于 ChIP 片段末端附近的 BciVI 位点被消化。消化产生带有 3'A 突出端的双链 DNA 产物,适合在测序之前直接连接至 Illumina 接头。
LinDA 方案(Shankaranarayanan 等人,2011 年)使用线性 DNA 扩增技术来增加 ChIP 程序后可用的 DNA 量。LinDA只需 30 皮克的染色质免疫沉淀DNA,相当于 5,000-10,000 个细胞,就可以对转录因子和染色质相关蛋白进行全基因组 ChIP-seq分析。LinDA 还有一些其他重要的功能,包括:
最近对 ChIP 方案、预扩增方法和新一代测序文库制备方法的改进大大降低了成功进行 ChIP 测序所需的最小样本量,从约 1,000 万个细胞降低至 5 或 10 万个细胞。
虽然这代表了巨大的进步,但研究界的目标是最终能够研究单个细胞,甚至是单个 DNA 分子。基于迄今为止的巨大进步,单细胞分析有望在未来几年内成为技术现实。
参考文献