蛋白质印迹法培训第 3 周 – 优化与疑难解答
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在蛋白质印迹法系列培训的第 3 周，我们将说明如何检测组蛋白和磷酸化蛋白质。在回答您的一些常见问题之前，我们先列出一些疑难解答提示。
概述
3.1 蛋白质印迹法疑难解答提示
3.2 用于蛋白质印迹法的优化二抗
3.3 蛋白质印迹法常见问题
3.4 磷酸化蛋白质印迹实验方案
3.5 组蛋白印迹实验方案
3.1 蛋白质印迹法疑难解答提示
所有实验和模式系统各不相同，因此有时即便按照通用标准实验方案，也可能无法获得您预期的结果。如果您在蛋白质印迹实验中获得的结果与您的预期不同，请查看我们的疑难解答提示。我们的疑难解答提示涵盖了所有常见问题的原因，例如无信号、高背景、多条带。
上样量应为多少？
3.2 用于蛋白质印迹法的优化二抗
相比于直标一抗，使用 HRP偶联的 二抗具有显著的优势，因为使用 HRP 或 AP偶联的 二抗能大幅提高灵敏度。
3.3 蛋白质印迹法常见问题
现在，您已经在此次课程中了解了蛋白质印迹的所有主要步骤，您应该充分了解获得结果需要进行的步骤。如仍有困难或任何不确定的问题，您可以在我们的蛋白质印迹常见问题列表中查找。
列表中包含的问题，例如
- 为什么蛋白质印迹法得到的条带大小与预期不同？
- 上样量应该为多少？
- 在检测一个重组蛋白时无法得到条带，这是什么原因？
3.4 磷酸化蛋白质印迹法实验方案
如果您想检测靶标的磷酸化水平？请务必小心处理您的样品，并使用正确试剂确保蛋白质结构的完整性。为使蛋白质保持在磷酸化阶段，将磷酸酶抑制剂添加到细胞或组织裂解液中，并且始终将样品置于冰上。此外要在 5% w/v BSA 而非牛奶中封闭转印膜，因为牛奶含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，这会导致高背景信号的产生。
3.5 组蛋白印迹实方案
组蛋白的分子量非常小，通常在 10–20 kDa 左右，因此在进行蛋白质印迹实验时要小心谨慎。首先，为了获得清晰的组蛋白分辨率，需使用较浓的凝胶。组蛋白很容易跑出凝胶，所以在电泳步骤（此课程第 2 部分中涉及）中，注意不要使染料前沿全部跑出凝胶底部。其次，使用孔径为 0.2 µm 的硝酸纤维素膜能最好地捕获组蛋白。
小结
现在您应该已经为处理一系列不同的蛋白质印迹类型做好了万全的准备。您还需要进一步了解
- 处理组蛋白
- 如何使蛋白质保持磷酸化状态
- 如何查找帮助和疑难解答提示
在第 4 周的培训中，我们将为您展示荧光蛋白质印迹法的相关内容。