蛋白质印迹法培训第 2 周 – 实验方案


在蛋白质印迹法系列培训第 2 周,我们将为您介绍主要实验方案以及一些关键步骤,并为您提供电泳和蛋白质转印的具体实验方法。最后,我们会说明关于剥膜再染的问题及其操作方法。

概述

2.1 电泳​
2.2 蛋白质转印和染色​
2.3 剥膜再染
2.4 蛋白质印迹实验方案

2.1 电泳​​

我们曾在第 1 周的培训中讨论过,蛋白质印迹法利用特异性抗体鉴定蛋白质。简言之,先制备样品,然后上样和跑胶,根据大小分离蛋白质。

可以采用一维(即在一个方向上分离)或二维电泳。一维电泳用于大部分常规蛋白质和核酸的分离。蛋白质的二维分离用于指纹鉴定(fingerprinting),可以用于准确分离细胞中所有蛋白质。而本文仅重点讨论一维分离。

2.1 Electrophoresis

As we discussed in week 1, western blot makes use of specific antibodies to identify your proteins. In summary, you start by preparing your sample and then loading and running the gel to separate out the proteins according to their size.

Electrophoresis can be one dimensional (ie one plane of separation) or two dimensional. One-dimensional electrophoresis is used for most routine protein and nucleic acid separations. Two-dimensional separation of proteins is used for fingerprinting and can be used to accurately resolve all proteins present in a cell. However, here we will focus our attention on one-dimensional separation.

获取一维电泳的所有详情,包括 PAGE 凝胶制备和上样内参对照


2.2 蛋白质转印和染色

在蛋白质印迹法的这一步骤中,在蛋白质转印到特定的膜之前您需要确认蛋白质是否均匀一致地迁移。

下载详细蛋白质转印和染色实验方案及蛋白质可视化开发方法


2.3 膜再生与复染

剥离指去除一抗和二抗的蛋白质印迹膜,目的在于研究同一个印迹中的多个蛋白质(例如目标蛋白质和上样内参对照)。在这种情况下,只需剥离并再标记一个单独的膜而无需跑多个蛋白胶,这样会帮助您节省样品、材料和时间。

点击此处,查看完整实验方案


2.4 蛋白质印迹实验方案

在已经充分了解主要步骤之后,您可以在此查找从开始到结束的完整蛋白质印迹实验方案。

我们的蛋白质印迹实验方案包括您需要的所有溶液和试剂。

下载完整实验方案


小结

现在您应该已经为进行蛋白质印迹实验做好了万全的准备。您还需要进一步了解

  • 不同电泳种类
  • 蛋白质转印和染色的最佳方法
  • 查看每个印迹中一个以上的蛋白质时如何剥膜

在第 3 周的培训中,我们将为您展示如何优化蛋白质印迹实验与疑难解答。




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