蛋白质印迹法培训第 1 周 – 基础知识

在蛋白质印迹法系列培训第 1 周,我们将让您了解这一最常用且实用技术的基础水平。在您开始了解实验方案之前,很有必要掌握它的基本要点。

概述

1.1 什么是蛋白质印迹法?
1.2 抗体选择​
1.3 对照​
1.4 缓冲液和溶液​
1.5 样品制备

​​

1.1 什么是蛋白质印迹法?

蛋白质印迹法确定了样品间的相对蛋白质水平,并确定了靶标分子量,有助于深入理解蛋白质的翻译后加工。蛋白质印迹法用电泳分离凝胶上的蛋白质来实现这一目标。凝胶紧邻膜放置,同时施加电流引导蛋白质从凝胶迁移到膜上。然后将目标特异性一抗添加到膜上,用二抗和检测试剂实现可视化。

1.2 抗体选择

蛋白质印迹法的灵敏性与特异性取决于抗体质量。理想情况下,你可以选择不同于样品物种的一抗。如可能,选择一个经过敲除 (KO) 验证的一抗,以确保它能够与预期靶标相结合。经KO验证的抗体可以显著降低(即使无法杜绝)脱靶现象。

蛋白质可视化后,需要选择一个与一抗结合的二抗。使用与辣根过氧化物酶 (HRP)、碱性磷酸酶 (Ap) 等酶或蛋白质印迹专用优化荧光偶联物(例如 IRDye® 系列)连接的二抗,可提供高水平的灵敏度。HRP 或 AP 二抗灵敏度增加的原因是这些二抗与一抗能在多个位置发生结合,可以使信号放大。

点击此处,获取完整指南


1.3 蛋白印迹法的对照

在进行每次蛋白质印迹实验时,都需要考虑对照,这一点至关重要。对照可以帮助您识别意外的错误来源,包括随机错误和系统错误,在这些错误影响实验结果之前将其改正。

阳性对照

通过阳性对照可以快速了解实验方案能否成功执行。阳性对照泳道的结果呈阳性意味着您的实验方案可行,同时证实了其他结果的有效性。阳性对照泳道的结果呈阴性则表示您的实验方案中至少有一个步骤未正确执行,或您的抗体出现了问题。

提示:将过表达目标蛋白质的细胞系裂解物用作阳性对照。过表达裂解物阳性对照结果呈阳性,意味着您的蛋白质印迹实验方案可行,结果呈阴性则可能因为您的样品表达水平低或不足。

阴性对照

阴性对照可以指示结果的准确性,并使您能核对非特异结合和假阳性结果。

提示:使用细胞系裂解物或不会表达所检测蛋白质的已知样品组织(如 KO 细胞系/组织)。

点击此处,查找用于您实验室的细胞系裂解物组织裂解物

上样内参对照

上样内参对照通常是所研究细胞类型或样品中表现出高水平组成性表达的蛋白质,管家基因是不错的选择(如肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)、微管蛋白或线粒体蛋白)。上样内参对照证实了凝胶中的蛋白质上样量相同,故有助于使测得蛋白质水平实现标准化。它还可以确保样品间数据的可靠性,因为上样内参对照的表达水平应在不同样品类型中保持一致。

点击此处,获取蛋白质印迹对照指南


1.4 缓冲液和溶液

蛋白质印迹法需要若干缓冲液和母液。为节省时间继续后续过程,请尽可能提前并正确地准备好这些溶液。这些缓冲液和溶液的必需品有

裂解缓冲液

  • NP-40 缓冲液
  • RIPA 缓冲液
  • Tris-HCl

电泳缓冲液、转印缓冲液、封闭缓冲液

  • 上样缓冲液/Laemmli 2X 缓冲液
  • 电泳缓冲液
  • 转印缓冲液
  • 封闭缓冲液

点击此处,获取提前制备以上材料的溶液指南


1.5 样品准备

样品制备方法会对蛋白质印迹质量产生显著影响。以下视频快速介绍了如何制备适合蛋白质印迹法的样品。

​​

小结

现在,您应该对蛋白质印迹法的基本实验步骤有了更好的了解,

  • 提前制备适当的溶液
  • 花时间尽可能仔细地制备样品
  • 基于种类和研究需求选择一抗,为提升灵敏度,考虑使用二抗与 HRP 或 AP 等酶的偶合物
  • 务必正确使用阳性和阴性对照

在第 2 周的培训中,我们将为您介绍完整的蛋白质印迹实验方案,包括蛋白质转印、凝胶电泳和膜再生。




注册