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图一:RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS靶点蛋白结构。图片来源:SWISS-MODEL。 |
RNA 聚合酶 II是一个大型多蛋白复合体,作为 DNA 依赖的 RNA 聚合酶,能够利用四种核糖核苷三磷酸作为底物催化 DNA 转录为 RNA。
RNA 聚合酶 II 最大亚基的 C 末端结构域 (CTD) 由含有七肽 YSPTSPS (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) 的串联重复序列组成。
RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (RNA poly II CTD) 富含潜在的磷酸化位点。它的磷酸化可以通过调节染色质修饰酶和RNA加工蛋白募集到转录基因的过程,从而整合染色质重构和新生 RNA 加工转录。
RNA poly II CTD可以作为平台,为转录起始、延伸、终止和mRNA加工募集各类调控因子。
RNA poly II CTD是一个分子量为217 kDa的大蛋白,并且存在多位点磷酸化翻译后修饰。
RNA poly II CTD主要定位于细胞核。高磷酸化和活性形式的RNA poly II CTD定位于细胞核,去磷酸化形式定位于细胞质。
图二:RNA poly II CTD ICC实验结果图重组Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS抗体[EPR24494-59] (ChIP Grade – BSA and Azide free) (ab300576)样本名称:HeLa细胞系绿色:RNA poly II CTD,红色:Tubulin,蓝色:DAPI实验结果:共聚焦图像显示HeLa细胞的细胞核染色 |
人(P24928):异构体1-2:64-217 kDa(预测)
小鼠(P08775):217 kDa(预测)
C 末端结构域 (CTD) 中的串联七肽重复序列可以被高度磷酸化。
RNA poly II CTD被 WWP2 泛素化后,导致其在蛋白酶体降解。
RNA poly II CTD可能发生甲基化修饰。
RNA poly II CTD可能发生乙酰化修饰。
RNA poly II CTD是大分子量蛋白,推荐使用大分子量蛋白的电泳转膜条件进行实验。
由于RNA poly II CTD存在磷酸化等翻译后修饰,WB实验中实际检测到的分子量大小可能(220~270 kDa)与预测分子量(217 kDa)不符。(图4)
HeLa细胞系。
图三:重组Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS抗体[EPR24494-59] (ChIP Grade) (ab300575)泳道1:HeLa全细胞裂解液泳道2:293T全细胞裂解液泳道3:NIH/3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)全细胞裂解液泳道4: PC-12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)全细胞裂解液泳道5: RAW 264.7全细胞裂解液实际检测条带大小:250 kDa | |
图四:重组Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2)抗体[EPR18855] (ab193468)泳道 1:PC-12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)全细胞裂解液泳道 2:用 Lambda 磷酸酶处理的PC-12 全细胞裂解液预测条带大小: 192 kDa实际检测条带大小: 270 kDa |
RNA poly II CTD主要定位于细胞核,对细胞进行通透处理尤为关键。如果用醛类(例如4%PFA)固定细胞,推荐使用0.1-0.25% Triton-X 100室温通透10分钟。
PC-12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系)
图五:重组Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5)抗体[EPR19015] (ab193467)样品名称:PC-12实验方法:4%PFA固定细胞10分钟,用 0.1% PBS-Triton X-100 透化 5分钟,0.1% PBS-Tween 中的加入1% BSA/10% 山羊血清/0.3M 甘氨酸封闭1小时实验结果:绿色:RNA poly II CTD,红色:Tubulin,蓝色:DAPI。共聚焦结果显示PC-12 细胞系核染色。在31°C用λ磷酸酶处理5小时后RNA poly II CTD表达减少。 |