流式细胞术培训第 2 周: 样本制备和染色

欢迎来到我们的流式细胞术系列培训。我们首先介绍一些基本知识,比如了解您的细胞仪,接着介绍一些细节,最后介绍如何通过这项强大的技术获得最佳结果。

欢迎来到第 2 周的流式细胞术培训。这次培训我们将介绍一些基本步骤,如样本制备、对照设置以及直接和间接染色的选择。

概述

2.1 样本制备

2.2 对照

2.3 直接染色与间接染色

2.4 细胞内染色

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2.1 样本制备


实验开始时处理样本的方式会对你最终的数据质量产生较大的影响。

观看我们的短视频,了解如何完成此操作。

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以下是关于流式细胞术样本制备的一些重要提示,这些提示可能会帮助您

  • 最大限度地减少非特异性结合 - 使用 BSA 或 FBS 作为封闭剂。
  • 最大限度地减少抗体与 Fc 受体的结合 - 在样本染色期间加入 10% 同源血清或 5 mg/mL 未标记
    的 IgG。
  • 如果研究细胞内标志物,透化细胞膜 - 使用低浓度的非离子洗涤剂(高达 0.1%)。
  • 如果使用活细胞,防止细胞表面蛋白的内化 - 所有步骤在冰上进行,并于使用前在 4℃下 冷藏试剂。​​
  • 防止细胞损伤 - 避免出现气泡、剧烈涡旋、更换缓冲液时吸出全部溶液以及过度离心。
  • 防止细胞死亡引起的结块 - 添加 DNAse I(25-50μg/mL)和 5 mM MgCl2
  • 防止阳离子依赖型细胞粘附 - 使用不含 Ca/Mg2+的缓冲液。

您可以添加最多 5 mM EDTA,以进一步防止细胞粘附。在此情况下,您应该使用 BSA(0.1-1%)或经透析的 FBS(1-5%),因为未透析的 FBS 会取代 Ca/Mg2+。

  • 使用单细胞悬液 - 如果可能的话,使用细胞滤网帽过滤样本。如果没有,可以使用尼龙网筛,但这样可能会损失细胞。​
  • 防止堵塞系统 - 将细胞浓度维持在合理范围内(1 x 106 至 10 x 106个细胞/mL)。


2.2 对照

合适的对照可以帮助您区分真假结果并识别方法中的潜在问题。因此,您需要花时间正确设置对照,这一点至关重要。

确保您在以下几个方面设置了对照:

  • ​​ 细胞活力

由于非特异性结合和自发荧光水平增加,死细胞可能产生假信号,导致错误的结论。

    天然存在的细胞组分如 NADPH 核黄素可发出掩盖抗原特异性信号的荧光。​

  • 使用等分的未染色细胞来控制自发荧光。您还可以使用未染色细胞来定义阴性细胞群、细胞大小和粒度。
  • ​​​光谱重叠

​  可以在不同的通道中检测到一个荧光团发射出的荧光。这种现象会严重影响给定通道的测量结果。

  • 使用荧光扣除对照(FMO)可以测量给定通道中溢出的量度。这里,除了正在检测的荧光偶联物,用所有其他荧光偶联物对样本进行染色,突出其他荧光偶联物对未标记通道信号的影响。
  • 或者,请参阅我们的详细补偿指南,以获取详细信息。
  •  不需要的抗体结合​​​​​

​    当抗体与脱靶表位或 Fc 受体结合(但不作为受体-配体相互作用)或通过其偶联的荧光团与表位或 抗原结合时,会发生这种情况。

  •  使用阴性(缺乏目标抗原的细胞)和同型与一抗同型的抗体;其中,一抗对您正在观察的细胞中不存在的抗原具有特异性)对照可以解释这一点。

请参阅我们的推荐对照列表


2.3 直接染色与间接染色

​​​直接和间接实质上是指检测分子的位置,如荧光团。对于直接流式细胞术,荧光团直接与一抗偶联。在间接流式细胞术中,荧光团与结合一抗的二抗偶联 - 这样可以通过额外的方案步骤来扩增信号。


2.4 细胞内染色

虽然常用于检测细胞表面标志物,如 CD 蛋白,但流式细胞术也可用于检测细胞内蛋白,如转录因子。要做到这一点,您需要在染色细胞之前使用固定和透化步骤。


总结

第 2 周的培训已经结束,希望您会对以下内容有更多了解:

  • ​样本制备的关键点
  • 各种类型的对照以及其操作方法
  • 直接染色与间接染色
  • 如何使用流式细胞术来观察细胞内蛋白

第 3 周,我们将进一步讨论补偿和数据分析。



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