流式细胞术培训第 1 周:了解您的流式细胞仪

欢迎来到我们的流式细胞术系列培训。我们首先介绍一些基本知识,比如了解您的细胞仪,接着介绍一些细节,最后介绍如何通过这项强大的技术获得最佳结果。

​​在第 1 周的流式细胞术培训中,我们将带您了解流式细胞仪背后的核心概念,然后继续讨论荧光团以及如何根据您的需要选择正确的荧光团。

概述

1.1 流式细胞术简介

1.2 流式细胞仪

1.3 了解荧光团

1.4 选择合适的荧光团


1.1 流式细胞术简介

流式细胞术是一种高通量检测技术,可以在每秒或几秒钟内对多达数千个单细胞进行多信息多参数分析。观察细胞大小、细胞质粒度或光合色素等物质时,流式细胞术通常采用试剂或探针进行结构分析。添加正确的探针后,可以扩大这种结构分析的范围,探索 DNA 或 RNA 含量。

流式细胞术的常用方法有两种,免疫表型分型(通过特征性内源细胞标志物的存在/不存在鉴别细胞群)和活细胞的荧光激活细胞分选术(FACS)(根据荧光标记将一个细胞群分成多个亚群)。

以下是流式细胞术的常见用途:

无需试剂或探针

  • ​​​结构性分析
    • ​​​细胞大小
    • 细胞质粒度
    • 光合色素

需要试剂或探针

  • ​结构性分析
    • ​​​DNA 含量
    • RNA 含量​

  • 功能性分析
    • ​​​表面和细胞内标志物
    • DNA 合成
    • DNA 降解(凋亡)
    • 细胞质 Ca2+
    • 基因表达


1.2 流式细胞仪

流式细胞仪利用散射和发射荧光组合来产生数据。通过流式细胞仪运行样本(通常是细胞悬液)时,鞘液用于以流体动力学聚焦方式迫使细胞悬液通过小喷嘴,并以单细胞方式通过激光(图 1)。前向和侧向散射光(分别为 FS 和 SS)以及染色细胞发射的荧光通过检测器收集。

​​ 1.流式细胞仪概述。

FS 与细胞大小有关,SS 与细胞的粒度成正比,您可以根据细胞群的大小和粒度来区分细胞群。

阅读关于流式细胞仪如何工作的完整介绍


1.3 了解荧光团

荧光团(或荧光染料)吸收并发射波长范围内的光,并且通常作为检测试剂与抗体偶联。荧光染料吸收光和发射光的波长分别构成荧光染料的激发光谱和发射光谱(或简称荧光光谱)。

​​

1.:荧光团的激发和发射基础原理。1)荧光团吸收特定波长的光能。2)光吸收诱导荧光团的电子激发。3)电子恢复基态后,荧光团以更长的波长重新发射吸收的光能。下:FITC 的激发和发射光谱。

了解有关荧光团的更多信息。

1.4 选择合适的荧光团

首先,为实验选择合适的荧光染料可能具有一定的挑战性,特别是在计划使用两种或多种荧光染料进行多色实验时。

我们开发了一种新的选择工具来帮助解决这个问题。

对于多色实验,您必须了解荧光染料之间的光谱重叠,以便最大限度地减少荧光溢出等问题。进行多色实验时,直接偶联抗体是最佳选择。

下面是一张荧光染料图表,可让您快速识别荧光染料中任何可能重叠的光谱。

在光谱被覆盖的情况下,您需要考虑荧光团相对于抗原表达水平的亮度。总的来说,

  • 对于抗原表达水平低或抗原表达情况不明的靶标或罕见的细胞群,您应该使用更明亮的荧光染料,例如 PE

  • 对于抗原表达水平高的靶标或常见的细胞群,您应该使用更暗的荧光染料,例如 PerCP

观看下面的短视频,了解有关选择合适荧光团的更多信息。

​​

总结

这就是第 1 部分的内容。本节课结束后,您应该:

  • 更好地了解了流式细胞仪的工作原理
  • 了解了荧光团及其不同的光谱
  • 有能力为您的实验选择合适的荧光团

下周我们将介绍样本制备和流式细胞术染色。


注册