ELISA 所需的对照样品

​​了解您在 ELISA 实验中所需的对照品。

适当的对照品可以帮助您准确区分真阳性结果和潜在的假阳性结果。当您需要对实验方案进行疑难解析时,阳性和阴性对照也十分重要。在此,我们将为您解释ELISA实验中使用各种对照的必要性。

内容

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​​阳性对照

可使用已知含有目标蛋白的内源性可溶样品,或已知含有检测抗体免疫原的纯化蛋白或多肽来作为阳性对照。当样品的检测结果为阴性时,阳性对照的阳性结果可表明实验过程无误且有效,所以实验的阴性结果是真实的。

我们建议阅读抗体的产品说明书,通常其中会有适合的阳性对照推荐。如果没有对照推荐,我们建议如下:

  •  检查抗体是否存在任何 Abreviews®。成功实验结果中所使用的任何组织、细胞或裂解物均可被视为适合的阳性对照。
  • 打开说明书上的 Swiss-Prot  或 Omnigene 数据库链接。这些数据库通常会有蛋白表达水平的组织列表。高表达的组织也可被视为阳性对照。

  • 在 GeneCards 中搜索目标蛋白。这里通常会为您提供各种组织中目标蛋白的表达水平。

  • 如果您仍然难以找到合适的对照,我们建议在 PubMed 上进行一次快速的文献检索,查看哪些组织和细胞表达目标蛋白。


阴性对照

阴性对照指的是已知不表达目标蛋白的样品。其有助于检测非特异性结合和假阳性结果。为验证结果,您使用的每个微孔板均应包含一份阴性对照样品。


标准品

标准品是一种含有已知浓度的目标蛋白的样品,可从中获得标准曲线。例如,以下是我们的小鼠 IL6 ELISA 试剂盒的典型标准曲线,浓度范围为 15.6 至 500 pg/mL。标准曲线不佳意味着抗体未正确结合或未捕获蛋白标准品。趋势线的 R2 值应 > 0.99。


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样本基质(加标对照品)对照中的标准品

在 ELISA 中检测血清样品时,按照惯例标准品用正常稀释缓冲液来稀释。但我们建议您同时用检测的种属血清来稀释标准品。然后可以将两者进行比较,以确保血清中的其他蛋白质对标准曲线没有影响。这就是所谓的加标对照,并可表明目标蛋白在加入基质后的回收率。可接受的结果为 80%-120%。

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内源性阳性对照

如果您正在检测重组蛋白样品,我们建议您纳入内源性阳性对照。这应该是您实验的一个必要部分。

重组蛋白的抗体检测存在一些固有的困难,需要考虑到重组蛋白的折叠可能与内源性天然蛋白的结构不同,并可能阻止抗体结合表位。标签蛋白的情况尤其如此,所以建议确保标签位于重组蛋白的N端或C端。

最重要的是,务必确保重组蛋白中包括您所使用的抗体的免疫原序列。内源性阳性对照对验证实验结果,以及说明试剂(例如抗体)和实验过程的有效性,起到重要作用。

ELISA 指南

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