抗体基础第 3 周:验证、对照和优化

​​​​欢迎来到我们关于如何正确选择和使用抗体的系列培训。在这里,我们将指导您如何选择最适合您实验需要的抗体,如何处理和储存通过验证的抗体,以及如何解决实验过程中遇到的疑难问题。


第3周: 抗体验证,对照设置以及实验优化

​​在前两周的课程中,您已经掌握如何挑选满足实验需求的抗体,并且学会了如何对抗体进行分装和保存,那么,接下来您需要考虑的是如何进行抗体验证,对照实验设置以及实验步骤优化以获得最佳的实验结果。


概述

3.1 验证您的抗体
3.2 选择您的对照
3.3 优化您的实验
3.4 实验方案

​​

3.1 抗体验证


抗体实际上是一种多变试剂,因此,在实验过程中为了获得预期的实验结果,有必要对抗体进行验证。一个好的供应商已经对抗体进行过验证,但是往往难以覆盖科研工作者手中拿到的每一个抗体。那么,您自己的实验验证就显得非常重要,因为这直接和您的实验相关。

下面是一些最常见的用于验证的方法。


验证


验证


局限性

KO 模型


用遗传工具(如CRISPR)敲除蛋白质编码基因

  • KO 细胞系作为可靠的阴性对照
  • 确保没有靶基因表达
  • 可在短时间内产生大量的 KO 细胞系
  • 敲除细胞系可用于所有分析实验—Western blot、IHC、ICC、流式细胞术
  • 针对特定基因的敲除细胞系不一定能存活


蛋白质印迹


样品中蛋白按分子量大小分离后,将其转移到膜上,然后通过抗体检测对蛋白质进行检测和定量.

  • 可以根据靶蛋白分子量确定抗体的特异性
  • 可用于检测天然蛋白或变性蛋白
  • 定性分析
  • 可以评估不同细胞区室(亚细胞结构)中蛋白质表达水平
  • 实验过程耗时
  • - 难以确定最佳实验条件(如:方法和缓冲液)
  • 每次只能验证少量抗体

IHC and ICC


通过特异性抗体和报告分子来检测组织(IHC)或细胞(ICC)中的蛋白质

  • 根据细胞定位验证抗体是否能识别正确的蛋白
  • 根据表达或不表达靶蛋白的细胞确认抗体特异性
  • 定性分析
  • 不能确定抗体是否会非特异地识别具有相同细胞定位的其他蛋白
  • 通常难以确定不同类型的细胞或
  • 组织是否表达该蛋白

>>> 获得抗体验证的完整指南,包括质谱/IP-MS,细胞治疗等等!


3.2 选择您的对照


您实验所需要的对照将取决于您所计划的试验。然而,无论您进行哪个实验,您都应该尽可能包含阳性和阴性对照。这看起来很乏味且费时,但它确实是给您的实验结果提供有效性的唯一方法。所以,从一开始就养成使用正确对照的习惯。从长远来看,您会感谢我们的。

组织和细胞对照

我们知道,要找到一个相关的细胞系对照或组织对照可能很难,这意味着您需要查阅一些文献。但是在您订购含敲除细胞系或者查阅文献之前,这里有一些数据库介绍了基因表达的有用信息,可以作为对照样品了解的一个很好起点:

观看下方的视频,了解如何搜索这些数据库:

Part 3 - Searching protein databases

​​​​应用特异性对照

蛋白质印迹的推荐对照
想要优化您的蛋白质印迹实验?找到蛋白质印迹的推荐对照。

IHC的对照
在IHC染色实验中设置对照是至关重要的,它可以确认所观察到的染色结果是真实、准确和可靠的。

流式细胞术的对照
通过使用适当的对照来改善您的流式细胞术结果。


3.3 优化您的实验


当实验技术、抗体、对照和抗体验证都得到确认后,最后需要做的便是优化实验步骤。这样做的主要原因是确保您看到只有特异性染色,并减少任何非特异性的背景信号。这里要考虑的因素包括孵育时间、封闭条件、缓冲选择和抗体稀释等。

抗体稀释

您在抗体数据表上可以看到抗体的最佳稀释浓度,,但这对于您的实验设置来说可能不是一个最佳选择。出于这个原因,您应该确定哪个浓度能够给出最佳信号。最实用的方法就是在滴定实验中使用一系列稀释倍数。例如,如果一个产品数据表建议使用1:200稀释,那么我们建议按1:50,1:100,1:200,1:400和1:500进行梯度稀释。

如果您有一个未纯化的抗体,并且不知道合适的稀释比例,您可以参考下面的表格。



组织培养上清液


腹水


含抗体血清


纯化的抗体

蛋白质印迹/dot blot

1/100

1/1000

1/500

1 µg/mL

IHC/ICC

1/1–1/10

1/100

1/50–1/100

5 µg/mL

EIA/ELISA

1/1000

1/10000

1/500

0.1 µg/mL

FACS/流式细胞术

1/100

1/1000

1/500

1 µg/mL

免疫沉淀

N/A

1/100

1/50–1/100

1–10 µg/mL

浓度估计

1–3 mg/mL

5–10 mg/mL

1–10mg/mL

N/A













在优化路线的同时,也要花点时间来优化抗体孵育的时间、如何封闭(BSA,酪蛋白,血清,商业封闭试剂等)以及您正在使用的缓冲液类型。这些步骤会帮助您获得更加准确的实验数据。

在开始的时候投入一点时间,可能会让您在接下来的几周内节省更多的时间。

>>> 获取更多关于稀释和滴定的信息


3.4 Step-by-step 实验方案


这些实验方案为您提供了以下步骤:样品准备,抗体孵育和数据可视化。为了获得最佳实验结果,我们还提供了优化的实验方案,包括我们抗体数据表上推荐的稀释法。

在下面获取您的实验方案指南


以上是第三周的全部内容!

下周,在本系列的最后一篇中,我们将为您解答在免疫实验中遇到的常见问题,如蛋白质印迹法,IHC和流式细胞术。

您将学习如何解决以下问题:

  • 没有/弱信号
  • 高背景
  • 不正确的染色

我们还将为您提供一些其他实验技术的详细疑难解答指南,以保证您实验的顺利进行。


回顾

如果您错过了或者想要重温之前的课程,您可以点击下面的链接:

第1周:选择正确的抗体

第2周:储存和处理您的抗体

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