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SimpleStep ELISA® 试剂盒简介网络研讨会

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主讲人 Russell Neuner 博士和 Daniel Schwartz 会向您介绍 SimpleStep ELISA® 试剂盒如何将检测时间缩短至 90 分钟。

了解 SimpleStep ELISA® 试剂盒是如何通过一个简单的抗体和样品添加步骤来特异且灵敏地定量靶蛋白。

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网络研讨会主题:

  • SimpleStep ELISA 试剂盒的工作原理
  • SimpleStep ELISA 试剂盒在研究中的应用
  • SimpleStep ELISA 试剂盒相比于传统夹心 ELISA 的优势
  • 产品和分析性能的特点
  • 使用 SimpleStep ELISA 试剂盒进行数据生成和分析


主讲人简介:

Russell Neuner 目前是 Abcam 的高级科学家,他在美国马萨诸塞大学获得了分子和细胞生物学博士学位。


SimpleStep 酶联免疫吸附测定 (ELISA) 试剂盒介绍

大家好,欢迎参加abcam SimpleStep ELISA 的在线讲座。今天的主讲人是 Abcam 资深科学家 Russell(罗素)Neuner (诺伊娜)。Russell在美国马萨诸塞大学获得分子和细胞生物学博士学位。

与 Russell一起演讲的是 Abcam 商务经理 Dan Schwartz (施瓦兹)。现在有请Russell,开始本次在线讲座。

RN:谢谢,Lucy。今天我要向大家介绍一个 Abcam 的全新技术, SimpleStep ELISA 。这种技术具备改良和差异化的性能特点,同时保留了传统 ELISA 的操作过程和标准数据输出方式。今天的在线讲座将围绕以下几个主题进行:SimpleStep ELISA介绍;重点产品特性和分析性能特点;与传统 ELISA 相比的优势;SimpleStep ELISA 在科学研究中的各种应用;以及,以一个试剂盒产品为例概述数据和分析。

“ELISA”是指酶联免疫吸附测定试验。这种实验室技术用于 从复杂的混合物或溶液中定量检测特定的分析物。相比于western blotting等其他免疫测定技术,ELISA 提供了更好的特异性和动态范围。

最常见的 ELISA 类型是夹心法 ELISA,这种方法是使用两种抗体来检测,如人血清或细胞培养提取物等生物样品中的特定靶蛋白。在双抗夹心法 ELISA 中,一种抗体被包被在微孔板每个孔的底部。这种抗体被称为捕获抗体,在样品孵育后该抗体与靶蛋白进行结合。另一种是偶联报告酶,如偶联辣根过氧化物酶 (HRP) 的抗体。这种抗体称为检测抗体,两种抗体搭配使用来完成双抗夹心法 ELISA。

SimpleStep ELISA 遵循同样的方法,并且也基于双抗夹心法 ELISA 的形式。SimpleStep ELISA 使用一种偶联亲和标签的捕获抗体以及一个偶联HRP 的检测抗体。这两种抗体搭配使用一同完成双抗夹心法 ELISA。为了保持夹心复合物结合在微孔板上,SimpleStep ELISA 中微孔板的每个孔都预包被有高特异性的抗标签单克隆抗体。这种抗体能够结合捕获抗体偶联的亲和标签,这是这项技术中必不可少的一步。

现在,我将展示一个简短的动画来介绍 SimpleStep ELISA 的实验流程。首先按照实验设计调整可拆卸的微孔板条。正如我前面提到的,SimpleStep ELISA 中微孔板的每个孔都预包被了具有高度特异性的抗标签单克隆抗体。在每个孔中加入 50 µL 的蛋白标准品或未知样品。下一步,在每个孔加入 50 µL 包含捕获抗体和检测抗体的抗体混合物。

室温振动孵育 1 小时以保证抗体和分析物的充分混合。在这个孵育过程中,抗体与靶蛋白结合,同时夹心复合物结合到 SimpleStep 微孔板上。

1 小时孵育后,进行清洗步骤以去除未结合的分析物样品和抗体混合物,仅留下被固定的夹心复合物。

下一步,在每个孔中加入检测试剂 (TMB) 并孵育 10 分钟。孵育后,在每个孔中加入终止液。最后使用标准微孔板分光光度计在 450 nm 波长下测定信号强度。

这是目前为止所讲述内容的总结,可以直接进行并排比较,左侧的SimpleStep ELISA,和右侧的传统 ELISA方法。每一种技术都是从试验设置或样品和试剂的制备开始。这一步通常需要约 1 小时,取决于检测的样品数量。

接下来进行 1 小时的孵育;在传统 ELISA 中,这一步仅为样品的孵育,可能需要多达 2 小时,取决于生产商的操作说明。在 SimpleStep ELISA 中,这一步是共同孵育了样品和抗体混合物,其中包括捕获抗体和检测抗体。

1 小时孵育后,SimpleStep ELISA 可以进行清洗、检测和分光光度计读数。传统 ELISA 需先进行洗脱后,加入检测抗体后再另外孵育 1 小时。

市售的大多数商业化ELISA 产品使用的是生物素化的检测抗体。这种类型的检测抗体需要额外的报告酶孵育步骤。一种常见的生物素化检测抗体的报告酶是一个偶联 HRP 的链霉亲和素分子,因此,传统 ELISA 需要额外的1小时孵育步骤。

最后 1 小时孵育结束后,传统 ELISA 准备进行洗脱、检测和分光光度计读数。

总的说来,传统 ELISA 需要长达 4.5 小时的连续等待时间。然而,相比之下SimpleStep ELISA 大约只需一半的等待时间,约 2.5 小时。

在实验室应用SimpleStep ELISA 技术有很多优势:首先,正如其名,SimpleStep ELISA 的流程十分简单!此外,SimpleStep ELISA 的实验流程时间缩短,降低了操作的复杂度;检测时间缩短,可以更容易、更快地生成数据。SimpleStep ELISA 保留了传统ELISA的操作过程和标准数据输出。因此不需要特殊培训或额外购买仪器。捕获抗体和检测抗体的液相孵育反应动力学使得检测具有高度灵敏性。

此外,液相孵育使得捕获抗体和检测抗体在溶液中与目标分析物相互作用,使结合过程更加有效。这是与通常在微孔板中包被了捕获抗体的传统 ELISA 相较而言的。SimpleStep ELISA 具有单一的孵育步骤和单一的洗脱步骤,可减少样品处理步骤的数量,使检测实现更好的重复性和准确性。最后,SimpleStep ELISA 技术允许在单个的微孔板上同时检测平行靶标。在讲座的下一节将讨论 Abcam 的多靶标 SimpleStep ELISA 试剂盒。

Abcam 的每个 SimpleStep ELISA 试剂盒都包含实验用的以下试剂。一个 可进行 96 次试验的SimpleStep ELISA 微孔板;其预包被了具有高特异性单克隆抗体。一个 5X 的细胞提取缓冲液;专门用于细胞培养和组织样本提取。一个浓缩的 10X 捕获抗体和 10X 检测抗体,以及在单一洗脱步骤中使用的 10X 洗脱缓冲液,TMB 检测试剂和终止液。

此外,每个 SimpleStep ELISA 试剂盒都包含一个蛋白标准品,这个高度纯化的蛋白可用于制作如右边所示的标准曲线。每个标准曲线使用 4 参数拟合的非线性回归模型绘制。蛋白标准品在未知样品中的靶标分析物数量的检测中是非常有用的。每个 SimpleStep ELISA 试剂盒包含有样品稀释液,也称为标准稀释液或校准稀释液。样品稀释液是一种特殊配制的缓冲液,优化过的缓冲液可以校正非特异性相互作用,如基质效应。SimpleStep 样品稀释液在不同样品类型中产生目标分析物的最大回收率。在右边的图中看到,与其他两种 ELISA 试剂盒相比,SimpleStep ELISA 检测在 5 个连续稀释浓度中的靶标分析物回收率接近 100%。

最后,每个 SimpleStep ELISA 试剂盒还包含一个抗体稀释液,也称为检测稀释液或封闭缓冲液。抗体稀释液是一种特殊配制的缓冲液,缓冲液经过优化可以减少抗体非特异性结合。它消除了如人抗鼠抗体 (HAMA) 等异嗜性抗体造成的干扰。异嗜性抗体存在于复合血清或血浆样品类型中,会在免疫分析技术中产生很强的错误或阳性的结果。右边的图显示,与常见的免疫分析封闭液相比,我们的 SimpleStep 抗体稀释液能够消除异嗜性抗体的干扰。

接下来,我们来讨论 SimpleStep ELISA 在研究中的应用。首先可以用来验证分泌蛋白生物标志物。在健康人与患者样本中对生物标志物进行定量研究 有助于发现病症的生物标志物,从而推动研究进展。这里展示的例子是凝集素蛋白或载脂蛋白J。图表显示了正常人血清的不同浓度和在十个正常健康的血清提供者中的凝集素水平。

第二,是对膜蛋白剪切的研究。对可溶性胞外结构域的检测,如细胞受体或配体以及细胞培养上清,可以为细胞脱落或剪接提供线索。

第三,是细胞内蛋白分析物的定量。能够用来检测细胞内蛋白或蛋白特异翻译后修饰位点的存在,可为细胞信号研究提供重要信息。左图的例子是线粒体 共济蛋白;测量各种癌细胞系中的共济蛋白,它在每种癌症类型中显示不同表达水平。右图所示是共济蛋白和弗里德赖希 共济失调症这一最常见的遗传性共济失调疾病的分析。对照组、携带组和 弗里德赖希 共济失调症患者的 B 淋巴细胞提取物中,共济蛋白表现出基于遗传的不同表达水平。

第四,是分析药物治疗后的蛋白水平。对于确定未知药物对癌症细胞系治疗的重要性,可能会更快、更特异性地发现治疗药物。所示的例子是缺氧诱导蛋白 HIF-1α。图中显示了去铁胺或 去铁胺 处理 HeLa 细胞的不同浓度。HIF-1α蛋白 在药物治疗后表达水平上调。

接下来,我将展示 SimpleStep ELISA 产品分析中所产生的数据类型。每个 Abcam 产品操作手册中都包含验证数据,样本制备推荐方案和样本类型的典型动态范围。今天,我将介绍检测人干细胞因子的SimpleStep ELISA 试剂盒,货号是 ab176109。干细胞因子SCF是 KIT 细胞受体广泛表达的配体。它是膜结合蛋白,可水解成可溶性配体。可溶性形式是高度糖基化的,在细胞外以同型二聚体形式存在。

配体结合后,KIT 受体被自体磷酸化激活,导致了下游信号通路的后续激活。干细胞因子在早期造血过程中,对刺激肥大细胞增殖作用十分重要。此外,干细胞因子可以介导细胞与细胞间粘着过程。

一种编码干细胞因子的基因缺陷会引起家族性进行性色素沉着症,最后,这种生长因子的功能异常可导致某些特定类型的白血病。

每个 SimpleStep ELISA 检测的可重复性或精确性会产生批内 差 和批间 差。批内差是基于单次实验中的蛋白标准曲线的值,而批间 差 是基于在特定时间段内的多个实验的值。所有批内 差 和批间 差 均小于 10%,符合行业标准。

这些值是非常重要的,因为精确度反映了用户获得的产品分析性能,并确保随着时间推移使用结果的一致性。灵敏度是按照最小可检测到的剂量计算的。人干细胞因子 SimpleStep ELISA 显示的灵敏度为 0.51 pg /ml。使用灵敏度值低的试剂盒的好处是可以节省有限的、昂贵的样品类型。如图所示,蛋白标准曲线数据以两种形式显示,用户可以以验证的数据作为参考。如右边显示的是 复孔实验测定的原始光学密度值。如左图显示的是,归一化或去背景蛋白的标准曲线数据。

回收率数据是通过设置回收率试验而实现的。在三种不同浓度的重组蛋白被加标到不同的样品模型中。加标蛋白的回收率可表明样品的某个成分是否会干扰测定。在我们的回收率分析中,常见的样品模型包括细胞培养上清、人血清和人血浆,使用三种不同抗凝剂来收集这些样品 以确保所有血浆蛋白的最大可回收率。

对加标或未加标样品模型进行连续稀释来检测稀释度线性。对于给定样品的线性分析表明,样品是否会在特定稀释度干扰目标分析物的准确检测。所有计算的回收率和稀释度线性数据均为正负 20%,符合行业标准。如果回收率或稀释度线性需要根据给定的样本类型进行校正,在每个 SimpleStep ELISA 试剂盒中配有专门配制的样品稀释液。

每个 SimpleStep ELISA 试剂盒都使用多个生物样品进行特异性验证。对十名、正常健康的献血者的人干细胞因子进行测量。这里是测量值和蛋白标准曲线。对所有的分泌血清或血浆靶标进行测试,数值均在世界卫生组织血液参考范围内。根据已知的 NIBSC 国际标准对 SimpleStep ELISA 进行校准,并包括数据比对的转换系数。

这是我今天在线讲座的内容。现在,我想介绍一下我的同事,Daniel,他将为我们介绍可购买到的 SimpleStep ELISA 试剂盒产品。稍后我会在后面对SimpleStep ELISA的常见问题进行回答。

DS:谢谢,Russell。我想简单介绍下我们的这一试剂盒与市售的其他试剂盒的主要区别。我们试剂盒最重要的特点是,简化的实验流程使得这些试剂盒非常容易使用。该试剂盒与现有的标准 ELISA 实验相比不需任何其他方法、技术或仪器。此外,新用户应该会发现这种方法特别容易接受。加速的测定时间能够将总检测时间减少至约 2 小时,这是由于该试剂盒应用的液相结合反应动力学孵育方式能够同时带来超高的敏感性和特异性。此外,SimpleStep ELISA 试剂盒是由 Abcam 自行研发。这为用户保证了批次间的可重复性,并可提供批次特定存储、大包装批次或特定批量需求的产品。SimpleStep试剂盒备有库存,可第二天交货,并且试剂盒的研发和使用是内部的知识信息。这使得 Abcam 能够提供最快、最可靠和最准确的客户支持。

目前的 SimpleStep 产品目录包含可检测各种靶标的试剂盒,主要是胞外和血清生物标志物,如细胞因子和趋化因子、肿瘤标志物、自信号或炎症蛋白。其他重要的研究领域,包括代谢、细胞凋亡、表观遗传学、蛋白磷酸化修饰和许多其他重要靶标。

Abcam 的 SimpleStep 网站主页提供了大量信息,如果你有兴趣了解更多内容,可以浏览我们的网站。这个 URL 链接将带您访问主页。

在这里你可以找到已发布的试剂盒最新列表和不同种类的反应性和敏感性,以及实验方法的技术信息,包括如何进行实验操作的动画。如Russell刚刚与我们分享过的。

此外,还有验证数据的示例附在每个试剂盒的产品页面上,链接到每个产品的单独技术数据表以及整体实验流程的概述。

或者,如果你想通过感兴趣的靶标找到相关的 SimpleStep ELISA 试剂盒,可以在 Abcam 主页的搜索栏窗口中首先输入你感兴趣的靶标,在产品下拉菜单选择“Kits”然后单击“确认”。

搜索结果出现后,可通过品牌关键词“SimpleStep”进行简单的筛选,即可呈现你想要的结果。

在我们的客户看来,与标准 ELISA 产品相比,该试剂盒的效果很好甚至要更优于前者,大多数用户非常喜欢该试剂盒的操作简便和节省时间。

女士们,先生们,今天的在线讲座到此结束。如果您有任何关于SimpleStep ELISA 的问题或者科学咨询,可以通过以下方式联系我们在全球各办事处的科学支持团队,我们很高兴为您服务。希望能在下一次在线讲座中再次与您相约。再次感谢各位参与本次讲座,祝各位研究工作顺利。

现在由Russell讲解,他将回答大家一些使用SimpleStep ELISA的常见问题。

一个问题是:SimpleStep ELISA 试剂盒的保质期是多久?

所有 SimpleStep ELISA 试剂盒已经过验证,自交付之日起保质期为一年。

下一个问题:如何在使用前后存储试剂盒组份?

这是一个好问题。SimpleStep ELISA 试剂盒全部组份的推荐温度为使用前放置于 4°C 冰箱存储,在使用前我们建议您拿出某些试剂,放置室温平衡。使用后任何剩余试剂的存储条件说明可在 Abcam实验手册中查阅,而且不同试剂有所不同。

另一个问题是:在使用这些试剂盒之前,我需要用任何特殊的提取缓冲液提取细胞吗?

正如我在讲座中提到的,每个 SimpleStep ELISA 试剂盒都带有 5X 细胞提取液。这是为我们的分析实验配制的。强烈建议使用此试剂进行细胞或组织样品的提取。如果仍有问题,请与我们的科学支持团队联系,他们很乐意帮助你解决相关的问题。

使用前需要清洗微孔板吗?

使用前不需要清洗 SimpleStep 微孔板。开启即用。我们建议根据实验设计来调整可拆卸的微孔板条,并将剩余的微孔板条放在提供的含有干燥剂的铝箔袋中,放置于 4℃保存。

如果改变了 SimpleStep ELISA 的孵育条件会发生什么?

改变 SimpleStep ELISA 的孵育条件,如温度、转速、培养时间、清洗时间,这些都会导致不良的结果。每个 SimpleStep ELISA 试剂盒已经验证过最大的性能优化,强烈建议按照 Abcam实验手册中的操作流程进行。


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