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Unique advantages of NeuN

免疫组织化学原理网络研讨会

观看免疫组织化学 (IHC) 原理网络讲座,Abcam专家将给予实验指导、分享实验诀窍。

了解如何获得最佳实验效果的技巧和技术。

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​​网络研讨会主题:

  • 样品制备
  • 免疫染色实验方案
  • 替代方案建议
  • 免疫染色实验用品​

​​主讲人简介:

Brendan Collins

Brendan Collins 目前是 Abcam 在美国马萨诸塞州剑桥的技术支持专家,他已在此岗位任职两年。他曾帮助很多客户解决问题和改善 IHC 实验的性能。

Brendan 2009年在美国波士顿学院取得了生物学学士学位。2012年,他在东北大学获得生物学硕士学位,期间他在 Fred Davis 博士的生理实验室学习并攻读博士学位,在这里他进行了小鼠脑立体定向手术及神经组织移植。他还进行了大量的小鼠灌注实验以及使用小鼠脑组织漂片进行了大量的免疫组织化学实验。

Brendan 2009年在美国波士顿学院取得了生物学学士学位。2012年,他在东北大学获得生物学硕士学位,期间他在 Fred Davis 博士的生理实验室学习并攻读博士学位,在这里他进行了小鼠脑立体定向手术及神经组织移植。他还进行了大量的小鼠灌注实验以及使用小鼠脑组织漂片进行了大量的免疫组织化学实验。

Tom Ruyle

Tom Ruyle 于 2006 年加入 Abcam 技术支持团队,其工作主要是帮助客户在免疫组织化学及其他应用中选择和使用抗体。

Tom 在美国马萨诸塞大学取得了微生物学理学学士学位,在此期间他在 Eric Martz 博士的实验室研究白细胞分化的标记物。在生物技术行业工作的这几年中,Tom 一直应用组织学和 IHC 技术研究溶酶体贮积症的蛋白质置换和基因疗法。

在回到马萨诸塞州加入 Abcam 前,Tom 和 Thomas Lee 博士在哥伦比亚大学共事,在此期间对缺血性再灌注损伤的信号通路进行了研究。


研讨会解说词:

大家好,我叫 Brendan。今天,我将向大家介绍免疫组织化学的原理及相关内容。

这里概括了我将要介绍的所有实验方案,以及每个步骤要讲解的内容。我会简要介绍 IHC,包括样品的制备方法,您可能会用到不同的实验步骤和样本形式。还有固定方法、石蜡包埋的处理方法,以及不同的抗原修复步骤。接下来会介绍不同的检测系统及它们之间的区别,以及您需要使用的对照。最后是如何使用复染试剂,如何制备用于分析的样本。 

首先我想用花几分钟讲讲 IHC、ICC、免疫荧光的区别;很多这类术语时常被提及,我希望在这里明确它们各自的含义。

IHC 是指免疫组织化学,组织化学是对组织切片中的抗原进行检测。而 ICC 是指免疫细胞化学,它是指对细胞爬片或细胞中的抗原进行免疫检测。这两种技术都通过报告标签将一抗与抗原的结合可视化,报告标签可以是酶促的,也可以是荧光的。使用酶促报告标签即免疫化学,使用荧光报告标签即免疫荧光。

免疫荧光这个术语时常被提及,但并不清楚实验对象是组织切片还是细胞。如果您正在寻找合适的抗体,制定相应的实验方案,那么正确区分这些技术的适用对象非常重要。所以,当提及免疫荧光时,请确定它指的是 IHC 或 ICC。 

在您开始研究之前,有很多因素需要考虑。

您需要根据抗原选择合适的抗体:抗原表位在什么位置、它可以识别哪一种异构体?您还需要确认您研究的蛋白在该样本中是否表达。这就是要用到阳性对照的地方了。您需要考虑研究目标蛋白所使用的样本类型,实验将会使用石蜡切片、冰冻切片还是细胞制备物等。

关于抗体,您需要考虑该抗体的物种交叉反应;关于蛋白,您需要考虑它的组织定位和细胞定位,或者染色时是否应该有信号。

您还需要考虑适合的固定方法,是否需要进行抗原修复,以及合适的抗原修复方法。

最后,抗体的工作浓度或稀释比例,以及抗体的物种来源也是需要考虑的重要因素。我们今天将详细介绍以上的内容。 

这是整个实验过程的流程图。接下来我将介绍样品处理、样品制备,及免疫染色。样品处理是第一步,您的实验有可能并不会涉及这一步。接下来就是样品制备步骤,然后执行免疫染色实验方案,该方案为 IHC 方案或 ICC 方案。最后是进行分析。

我会在接下来的几张幻灯片中介绍这些内容。 

样品处理 — 它代表什么意思? 

样品处理是指调控样本中蛋白的表达水平。它可以在细胞水平或体内水平进行。

如果是细胞实验,您可能需要使用适当的抑制剂或激活剂来上调或下调细胞中某种蛋白质的表达。如果是体内实验,原理也是一样的,但是在进行体内实验时,有许多因素要考虑,因为实验对象是活的实验动物。抑制剂或激活剂、激动剂或拮抗剂在选择时,应尽量避免由于非特异性结合其它蛋白所导致的非特异性效应。

我们需要确保细胞的渗透性,让化合物能真正进入细胞或血/脑屏障 — 如果您的实验对象是脑。需要确保所使用的化学品能够溶于合适的溶剂。还有最适合的给药途径 — 是注射还是口服。最后,完成上述所有步骤之后,您就可以获取组织或细胞样品了。 

样品制备 — 这里列出了样品制备所包含的内容。我们所说的样品制备是指组织固定、组织包埋、切片以及抗原修复。无论您的样品是什么,之后的免疫染色实验方案都非常类似:加入封闭液,孵育一抗,与二抗一起孵育,如果是免疫化学加入酶底物,最后盖上盖玻片,观察。

下面我将介绍您可能会用到的不同样本形式。 

免疫组织化学实验中最常用的样本类型是石蜡包埋的组织切片,福尔马林固定。原因是它们能够保持组织形态与蛋白抗原性之间的最佳平衡。蛋白质的抗原性是指抗体与蛋白结合的紧密程度以及能否在整个过程中保持结合状态。石蜡包埋的组织切片很稳定,并且易于使用。但是它也有不足之处,例如,免疫染色之前需要对切片进行脱蜡处理,这个过程很耗时。而且由于大多石蜡切片采用交联剂固定,因此必须进行抗原修复。

一般来说,石蜡切片适用于 4 微米厚的切片。如果切片厚度大于 4 微米,抗体可能会被困住,导致假阳性染色,这是我们需要避免的。 

另一种常见的样本形式是冰冻组织切片。当 Abcam 提到免疫组织化学中的冰冻切片时,或者当我们的说明书上提到 IHC-FR时,它指的是非醛固定。这对于不能经受醛固定处理和石蜡处理的抗原来说非常理想。因此这些抗原将呈现出更天然的状态。但冰冻切片的缺点是组织形态可能不佳,同样是因为组织没有使用醛固定。所以与石蜡切片相比,冰冻切片可能没那么好看。正因如此,它的技术难度更大,样品也因为同样的原因更加脆弱。同样地,冷冻切片通常也仅适用于厚度为 4 到 10 微米的薄切片,超过这个厚度的切片可能会困住抗原,导致假阳性染色结果。

如果您所要研究的组织类型无法做成这种厚度的薄切片,可以考虑采用漂片。该技术一般用于脑组织和脊髓,在发育研究中,这是一项非常有用的技术。该技术可用于厚度达 40 微米的更大切片。它的缺点是操作起来更加不便,顾名思义,组织样品始终没有被固定,整个过程中它们都处于自由漂浮状态,最后还必须将它们固定在载玻片上进行观察,操作有一定的难度。它的另一个缺点就是非常耗时,尤其是应用于神经科学研究时,动物用 BFA 灌注,这显然也是有难度的一步。所以每种技术都有优点和缺点,您需要选择对您来说效果最好的一种。 

最后,我想稍微介绍一下什么是细胞制备物。它们常见的形式是涂片。即载玻片上“液基薄层”的单分子层,例如刮取样品涂到载玻片上制成内皮涂片。或者,细胞制备物也可指培养的细胞系。同样地,您需要为自己的实验选择最适合的样本形式,选择的依据包括实用性和抗原性、与抗体结合的紧密程度,以及蛋白之间相互结合的程度。 

下面我将再进一步介绍固定方法,前面已经作了一些了解,在这里我进行详细介绍,希望可以解决你们的问题。

为什么我们需要固定组织呢?如果不进行固定,抗原将会完全丢失。我们还需要让组织尽可能地接近体内状态,因为我们希望看到它在in vivo时的实际形态,这可以通过固定来实现。固定时,我们通常将组织浸入醛类或醇类固定剂中,固定剂会渗透组织,通过使蛋白质的三级结构发生构象改变而让蛋白质失去生物活性。 

如果不进行固定,蛋白将在组织处理时降解,从而导致我们看不到任何染色结果。某些抗原在组织切除后只存在几分钟,在这种情况下我们必须快速操作。组织在其死亡的过程中会发生变化,导致其失去原有形态。样品中的蛋白酶会降解蛋白。细胞会经历坏死、自溶,然后还会受到细菌侵袭,所以我们必须迅速地进行固定操作。 

除非样品是冰冻切片,我们最常使用的是醛类固定剂。通常是福尔马林或多聚甲醛,这些都是醛类固定剂。福尔马林通常是 10% 的中性福尔马林,其中的总甲醛含量为 3.7%。多聚甲醛是甲醛的固体聚合物,所以 4% 的多聚甲醛溶液具有相当于 10% 福尔马林固定剂的能力。

那么,甲醛的作用是形成了这些交联桥 —如图中红色圆圈所示。它们形成了蛋白质三级结构中的这些交联桥,以保持它的构象状态,使其保持固定。它的缺点是,如果抗原表位在这些地方,抗体将无法渗透进去结合抗原,导致染色无信号。

这也是为什么抗原修复步骤很重要,我会详细地介绍一下这一点。 

如前所述,这些交联桥是亚甲基桥,它们使得相邻蛋白表面的赖氨酸残基发生交联。您可以想象,细胞质将转化为凝胶状的网状结构,从而使细胞变为静止状态,而且非常接近其在体内的状态,从而达到我们的目标。

除了醛类固定剂,免疫组织化学和免疫细胞化学研究中还会使用醇类固定剂,通常是乙酸、甲醇、及乙醇。它们通过破坏蛋白质三级结构中的内部疏水键改变蛋白质的三级构象。但是,由于二级结构中的氢键未受影响,二级结构得以保持,所以蛋白的结构仍然接近其天然状态。由于没有像醛类固定剂那样形成共价交联,所以您无需进行抗原修复。抗体能渗透进来,与它的抗原表位结合。对于那些对醛类固定敏感的抗原而言,醇类固定剂是理想选择。 

有了组织和抗体之后,确定严格的固定方案很关键,而且您必须始终保持一致。有很多因素会影响固定,例如固定剂的渗透速度 — 这将决定您需要将组织浸入固定剂中多长时间;

又例如样本大小 — 当然,表面积越大,固定就会越慢,所以应尽可能使用较小的样本,以保证彻底浸润。还有固定剂的浓度、固定的时间和温度等都是重要因素,固定剂浓度越大,固定温度越高,持续时间越长,固定的程度就越深。还有可能会固定过度,所以找到适合的时间、浓度和温度很关键。 

现在我将时间交给 Tom,他将为各位带来演讲的后面部分。他将介绍如何进行石蜡包埋

Tom:

感谢 Brendan。那么下面我将简要介绍如何进行石蜡包埋。正如 Brendan 提到的,这是认可度最高或最常用的样品制备方法,主要是因为它保留了组织的形态,而且样品经处理之后更容易长时间储存。处理的目的是将组织从含水的状态转变为有机状态,这样一来,石蜡就能渗入样品。该过程总共耗时 12 小时,其中包括梯度乙醇脱水,然后在透明剂二甲苯中浸泡几个小时。最后将组织放入熔化的石蜡中。

这里您可以看到几个例子,它们都是包裹在石蜡块中的组织。大多数人都会使用仪器来进行包埋,很重要的一点是需要样品以怎样的方向被包埋入石蜡中,以便制作切片。虽然大多数情况下,这些设备可以帮您切片,但是组织定位需要由您来确定。

如果对样本进行石蜡包埋,您需要注意几点。醇类本身就是蛋白变性剂,它会影响抗原性,即抗原与抗体之间的相互作用。后续步骤在 60 ℃下进行,这会使某些抗原降解,因此我们可以得到一条重要信息 — 并非所有抗原都可以在石蜡包埋中保存下来。在这种情况下,将样品制备冰冻切片可能更合适。一般而言,抗体供应商都知道某种抗体是否适用于福尔马林固定的样本,所以您可以通过查看说明书或联系供应商得到相关信息。 

接下来介绍抗原修复

Brendan 提到这是大多数免疫组化的重要组成部分。它通过破坏相邻蛋白之间的亚甲基桥来消除醛类固定的掩蔽效应。这些亚甲基桥会阻碍抗体接触其要识别的表位,如果不进行抗原修复,抗原的保留会很弱或根本不会被保留。

常用的抗原修复方法主要有两种:一种是热抗原修复,有时候它被缩写为 HIER,代表“热诱导抗原修复” (Heath-Induced Epitope Retrieval)。常用缓冲液是 pH6 的柠檬酸钠或 pH9 的 tris-EDTA。所谓的“热”是指在沸点温度或接近沸点温度的条件下处理组织切片 15 到 20 分钟。另一种抗原修复方法是酶促抗原修复法,常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶和蛋白酶 K。其操作就是将切片与上述的其中一种蛋白酶溶液一起孵育,能达到与热诱导抗原修复相同的效果。 

对于IHC,并没有通用的抗原修复方法,所以对于不同的抗体和抗原,一种选择可能比另一种更好。这页幻灯片展示了两个例子:两个抗体,一个是黄体酮受体的抗体,另一个是 E-cadherin的抗体,顶部的图片展示了不进行热抗原修复时的效果,您可以看到完全没有染色结果。然后使用了不同缓冲液,进行热抗原修复,不同 PH值的缓冲液,带来了不同的效果。对于黄体酮受体的抗体,您可以看到,效果最好的缓冲液是 pH3 的甘氨酸-盐酸缓冲液,pH9 的 Tris 缓冲液效果也不错。但对于 E –cadherin的抗体,我们可以看到,效果最佳的是 pH9 或 10.5 的 Tris 缓冲液。

所以能够影响抗原修复程度的因素包括:修复的时间、温度、修复液成分或 pH,以及所用的方法是酶抗原修复还是热抗原修复。 

下面我将介绍检测系统。 

这张图展示了免疫化学与免疫荧光。在上面的例子中,酶偶联的二抗识别一抗,当有底物存在时,我们得到了有色产物。下面的例子中,抗体的结合是一样的,但不同之处在于该二抗不是与酶偶联,而是与荧光基团偶联,该荧光基团在特定的激发波长下被激发,能够发出信号。 

我们可使用各种不同的酶促报告标签,免疫组化实验中主要使用的是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。它们都有不同底物,反应后得到不同颜色。对于辣根过氧化物酶,最常见的颜色是所列的第二种 — 棕色,底物是 DAB — 二氨基联苯胺,它不溶于醇类。而表格第一行的 AEC 底物,显示红色,但它可溶于醇类。另外,DAB 加镍增强剂会表现为黑色。

碱性磷酸酶我们这里列举了固蓝、固红、新品红的底物,其中两种可溶于醇类,另一种不溶于醇类。在使用上述不同试剂时,我们需要在操作的最后选用不同的封固剂,保证反应产物不会被封固剂溶解。

选择酶促报告标签时,需要考虑到在很多组织中还存在内源的酶。组织中的内源过氧化物酶能与 HRP底物发生反应,产生假阳性的染色结果。在与 HRP 偶联的抗体进行孵育之前,在切片上加入过氧化氢溶液可阻断该反应,该步骤通常紧接在抗原修复步骤之后。

大肠中存在内源的碱性磷酸酶,可通过孵育左旋咪唑溶液抑制该酶的活性。但是更实用的解决方案是使用 HRP,而不用碱性磷酸酶。

这里有各种荧光报告标签,其中Alexa Fluor® 染料的颜色更加明亮,对应的波长也各不相同,这张表展示了一系列不同的 Alexa Fluor® 染料,它们的激发波长,发射波长及颜色。 

荧光染料的选择取决于显微镜,您所使用的过滤片,以及您将要使用的复染剂。荧光染料和荧光复染剂需要经过筛选,使它们的激发波长和发射光谱不会重叠。这样就能让它们独立地被激发和被观察到。这就是荧光标记的主要优点之一 —您可以在一张切片上同时染多种荧光颜色,并且分别对每一种荧光信号进行观测。现有技术通过荧光染料的吸收波长、发射波长特性可以达到这一目的。

选择酶促标签还是荧光标签取决于您的实验,以及您最终要实现的目标。酶促标签可用于组织切片。荧光标签通常用于细胞样品,也可用于冰冻切片。

荧光的优点是我们可以分别观测各个通道的结果,也能将其重叠整合为一张伪彩色图像。通过荧光复染检测系统可以轻松观察信号的共定位情况。我们还能发现较弱的染色,即低丰度蛋白质,基本上,在某些应用中,它比酶促检测更敏感。这里我们展示了一个例子,这是使用相同的抗体进行小脑切片染色,所用的抗体是兔 NeuN 单克隆抗体。上图显然是使用 DAB染色的酶促检测结果,下图中的绿色部分是 NeuN 染色,红色部分是 GFAP 染色。它展示了荧光染色可同时进行两种染色的优势。 

荧光染色的缺点是由于某些组织成分具有自发荧光,例如胶原蛋白。另外甲醛固定会产生自发荧光,尤其是绿色通道的荧光,如果够强的话,它会掩盖荧光报告标签的信号,这会增加数据解读的难度。在这种情况下,酶促检测可能是更好的选择。

一般来说,细胞样品和冰冻切片暴露于甲醛中的时间不长,并且细胞样品通常不含自发荧光成分,没有这个问题。

现在我将介绍信号放大。之前我曾展示了一个图例,使用的是偶联的二抗。其优势之一是我们可以让多个二抗结合到同一个一抗上,与直标一抗相比,这样能够使信号放大。对于表达丰度较低的抗原的检测,还可以使用生物素化的二抗,使其与亲和素-辣根氧化物酶结合,形成 ABC 复合物。 

这张表展示了不同检测系统:第一种是对一抗进行直接标记;第二种使用带标记的二抗,能够放大信号。

其他选择还包括葡聚糖聚合物检测系统,亲和素-生物素复合物,即使用生物素偶联二抗,再加入亲和素偶联的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶,以及微聚合物检测系统,它是另一种聚合物检测系统。这三种检测系统可以最好的放大信号。

现在稍微总结一下检测系统,较常用的是使用带标记的二抗,操作只需两步:加入一抗进行孵育,漂洗,然后加入二抗进行孵育。没有内源生物素的问题,信号放大的程度低。这是与聚合物法或 ABC 法相比的缺点。 

亲和素-生物素检测系统,正如之前所说的,是亲和素、生物素、辣根过氧化物酶的复合物,能够实现与聚合物系统类似的信号放大。该方法涉及三个步骤:一抗、二抗,与 ABC 试剂。它的缺点之一是许多组织中存在内源生物素,如果內源的生物素水平高,我们需要对其进行阻断。否则将会产生大量背景信号,掩盖我们要检测的目标。

最后要特别提醒的是:链霉亲和素比亲和素的产生的背景少,因为亲和素带正电,而链霉亲和素是中性的,发生静电结合的可能性更低;大多数商品化的试剂盒都会考虑到这一点。 

葡聚糖聚合物检测系统,如图中所示,二抗上偶联了葡聚糖骨架,即图中紫线。小小的灰色圆形是酶报告标签,它们能够显著放大信号。由于葡聚糖骨架比较大,在检测某些组织某些成分时可能难以接近。

在这种情况下可采用微聚合物检测系统,它的原理与葡聚糖聚合物检测相同,但采用更小的聚合物,并且具有更大的酶连接臂。因此组织渗透效果更好。是遇到上述问题时很好的一种解决办法。

接下来介绍对照,这可能是操作流程中最重要的部分,使用它的目的是为了正确地解读数据。 

没有合适的对照,即使染色结果非常明显,本质上也是没有意义的。显然,对照的重要性在于验证我们观察到的染色信号是否真实、准确、可靠。有两种对照类型:一种是抗原对照,通常是使用阳性对照样品,如果可能的话,同时使用阴性对照样品。即样本已知表达与不表达目的抗原。第二种类型的对照是试剂对照,它的作用是就是观察是否有由试剂带来的非特异性结合,例如在您的流程中所使用的那些试剂。

现在介绍复染剂。 

复染的作用就是为了在观察组织中染色状况时显示细胞位置。使用最广泛的是苏木精,这是适用于光学显微镜的核复染剂,会产生漂亮的蓝色。它具有DNA特异性,所以可染色细胞核。但是如果复染的时间过长,细胞核形态会由于染色过度而发生改变,并且组织基质会产生背景染色。

这里展示了一个很不错的例子 —结肠组织切片的平滑肌肌动蛋白染色。图中的蓝色部分就是细胞核,它显示了细胞位置。没有这些,我们就只能看到一些棕色染色,那根本没有意义。下面是荧光检测系统,同样地,大多数情况下我们都想染色细胞核,这个例子是使用 DAPI 染色细胞核。

复染还可以对肌动蛋白丝或细胞质膜进行染色。它们需要有一定的颜色,这样我们才能将染色与目标蛋白区分开来,因此我们希望有明显的对比。

最后一步是为分析所做的准备, 

这个步骤就是为组织切片盖上盖玻片,能够保护切片,便于长期保存。使用适合的粘合剂,即封片介质将盖玻片固定到位。很重要的一点是,某些封片介质是水性的,适合荧光标签和酶促标签,有些封片介质是有机的,通常只适合酶促标签。

比起水性介质,有机封片介质的折射率与固定蛋白的折射率更匹配,因此使用有机封片介质的切片,图像一般会更清晰锐利。但需要考虑的是,如果您的底物和所用的色原可溶于醇类,当使用有机封片介质时,它可能会把您已经完成的所有工作都洗掉。所以在使用任何封片介质之前一定要考虑到色原在醇类中的可溶性。

这是我刚刚谈到的观点,例如,辣根过氧化物酶的色原AEC,是可溶于醇类的,如果脱水之后用醇类和二甲苯清洁切片,切片上的染色会被洗掉。荧光标签的信号在含有抗淬灭试剂的商品化介质中最稳定。最后,某些用于荧光染色的封片介质中已经包含了复染剂,典型的例子是 DAPI,这样一来流程中就不再需要单独的复染步骤了。 

总之,实验流程需要针对每种抗原进行优化,因此您需要仔细设计实验。

您要知道哪些步骤需要进行测试 — 例如抗原修复、抗体稀释。通常,如果您选择购买商品化的抗体,这些信息都能从供应商处获得。说明书上应该会有关于如何进行实验的一些建议,我刚刚讲的大部分内容都是与抗体优化相关的。了解这些信息通常都很有必要,如果您的研究对象此前还从未使用免疫组化检测过,您还能从抗体供应商处获得一些已经经过测试的指导信息。

您必须明确地知道预期的图像是什么样的,也就是说,您需要知道您想检测的是什么,前人的研究中观测到什么样的现象,特别是组织中蛋白的定位状况。您还要确定您所需的对照,以同型对照为例,选择与一抗相同亚型,但是没有特异性结合作用的免疫球蛋白来作为空白对照。这个对照是为了显示非特异性结合,如蛋白-蛋白相互作用所造成的背景染色。

还有一种是无一抗对照,不进行一抗孵育而其余操作步骤一致,这种对照可以显示由二抗非特异性结合所造成的背景信号。

然后,如果您有组织对照,这也很有用,通常如果您的阳性对照有染色而样品中没有任何染色结果,问题不是出在抗体上,而是组织切片中根本没有蛋白质,或所含蛋白质的水平低于抗体的检测限。

所以在开始实验之前要审查实验方案,确保试剂与试剂之间以及试剂与样品的兼容性:例如封闭剂、一抗和二抗,以及封片介质。

现在我将时间交给 Javier,他会为大家介绍 Abcam 的一些免疫组化领域的产品,以及相关的试剂盒和试剂。等 Javier 用几分钟介绍完产品之后,Brendan 和我会回来回答大家的提问。

J: 感谢 Tom 和 Brendan 带来的精彩演讲。大家好。开始介绍之前,我想提醒大家,您可以通过屏幕右侧 Q&A 版块向 Tom 和 Brendan 提交您的问题。Abcam 提供多种试剂盒和试剂产品,能够为您的 IHC 实验提供支持,包括血清和封闭剂、抗原修复试剂、色原、组织学染料和组织切片。我想借此机会向大家介绍一些我认为您可能会感兴趣的产品。 

我们拥有产品最丰富,且产品种类增长最快的高品质兔单克隆抗体系列。我们有超过 7,600 种 RabMAb 产品,而且该系列还在不断壮大。我们的 RabMAb 抗体具备 RabMAb 技术的所有优点,即高亲和性、高特异性以及稳定的性能。众所周知,如果您研究的是小鼠蛋白,我们的单克隆抗体同样能够为您带来的各种优势,您无需担心非特异性结合。

我们的 RabMAb 抗体在发布前经过了广泛验证。所有产品都通过相应物种的多种应用进行了测试。对于 IHC,我们一直使用 FFPE 组织芯片进行测试,包括人类、小鼠和大鼠组织。我们还有各种与 Alexa Fluor® 染料偶联的 RabMAb直标一抗产品。 

这里,您可以看到一个例子,这是我们的新 RabMAb 抗体 — ab177487。这个图片比较了不同商业化抗体对丙酮固定小鼠大脑齿状回切片进行染色的结果。竞争者 A小鼠单克隆抗体,竞争者B是其它公司生产的兔单克隆抗体。您可以看到,ab177487 即使在竞争对手抗体一倍的稀释度下也产生了很强特异性染色,而且背景最小。 

我们还提供 Alexa Fluor® 偶联的二抗。我们的 Alexa Fluor® 系列二抗不单是标准产品,更是以高品质为特色的高端系列产品。该产品是我们位于英国的内部实验室研发的,无论是荧光素偶联还是信号放大都能够达到高标准。Alexa Fluor®,可能在座的很多人都知道,是多色分析的理想荧光染料。我们提供九种不同 Alexa Fluor® 染料偶联的二抗,这些染料覆盖了整个光谱,而且光谱重叠很小。

这九种染料适用于目前的设备配置的最常用的激光。其中一些抗体特异针对同型的不同亚簇,如IgG-1 或 IgG-2A,可用于多色荧光染色实验。此外,其中很多抗体可以提供预吸附处理的产品,以确保在多色荧光染色时物种交叉反应性降至最低。 

如果您想用直接法来检测目标蛋白,但是市面上又没有商品化的直标一抗,或者您想要对自己制备的抗体进行标记,我们有抗体偶联试剂盒。让您能够迅速有效地标记您的抗体。这些试剂盒的操作非常简单,您只需向已纯化的抗体中加入modifier,混匀后加入偶联物中进行孵育。之后再加入猝灭剂进行孵育。快速偶联试剂盒的抗体的孵育时间为不到 20 分钟,而标准试剂盒的抗体的孵育时间约为三个半小时。有时候操作时间仅需约 30 秒。

由于没有过柱步骤,偶联结束后您可以得到100%的抗体。我们的偶联试剂盒提供包括荧光染料、HRP等酶标物、生物素、金标记的抗体偶联。上个月,我们又推出了一系列的Dylight偶联试剂盒

Brendan 已经为大家介绍过酶促检测和荧光检测的区别。荧光检测有一个大家可能已经知道的常见问题,那就是无论是在实验过程中还是在储存中,光漂白都会导致荧光信号丢失。我们用于免疫荧光实验的荧光封片介质是水性封片介质,具有特殊配方,能够抑制常用荧光标签的光漂白。如果需要保持荧光,延长储存时间,我们还提供含 DAPI 或碘化丙啶的 Fluoroshield 封片介质

接下来我将介绍检测试剂盒和检测方法。Brendan 已经提到了我们推出的 IHC 检测试剂盒,这些是基于微聚合物的检测试剂盒,比常规的基于聚合物的检测系统更敏感,因为微聚合物更小,它们比常规试剂盒中所用的大聚合物更容易渗透进组织。这些试剂盒不会与生物素反应,因此不会产生内源生物素背景。这些试剂盒的其他优点还包括其实验方案比大多数 IHC 检测试剂盒的实验方案更精简,而且包含色原、过氧化氢和蛋白质阻断剂,能为您提供更全面的解决方案。 

我们还提供小鼠对小鼠检测试剂盒,让您能够在小鼠组织上使用小鼠抗体,通过简单的实验方案就能得到干净的背景和清晰的信号。虽然我们的这些试剂盒是为酶促检测而开发的,但我想告诉大家,也有研究者将这些试剂盒用于免疫荧光实验。

最后,如果您想在同一个实验中研究多种组织,可以了解一下我们的组织芯片。我们的产品组合包括超过 200 种芯片,覆盖多个物种和病理学样品,例如不同肿瘤分级和不同 TNM 阶段的样品。每张切片包含多达 228 个福尔马林固定的样品:这些样品是客户订购之后新鲜制作的,具有样本损失极低的额外优势。 

我要介绍的内容就是这些,最后感谢大家的关注。

“MOLLY 提问”

我要介绍的内容就是这些,最后感谢大家的关注。事不宜迟,现在我把麦克风交给 Brendan 和 Tom,接下来他们将回答大家的一些问题。谢谢。

TR: 感谢 Javier。接下来我们将回答我们收到的一些问题,收到的问题很多,但遗憾的是在接下来的十几分钟时间里我们可能无法一一回答。

其中一个问题是使用单克隆抗体与多克隆抗体各自的优点和缺点是什么?举个例子,在 Abcam 产品目录中,您的每一种目标蛋白或靶标都有多种选择。这些产品有的是单克隆抗体,有的是多克隆抗体,一般来说,单克隆抗体的优点是产品的批次间一致性较高。而多克隆抗体每一次都需要免疫动物并收集血清进行生产。单克隆抗体特异识别单一表位,而多克隆抗体可能识别目标蛋白上的多个表位。有些人认为单克隆抗体特异性更高,其实不一定如此。基本上这因抗体而异。它们都会经过质量控制步骤,通过了质量控制检测才可以进行销售。所以就特异性而言,单克隆抗体与多克隆抗体相比不一定有优势。

是的,总而言之,单克隆抗体的批次间一致性更高,而多克隆抗体的不同批次间可能会存在差异。

我们看下一个问题:什么情况下需要透化组织或细胞,您有什么建议?对于薄的组织切片,制备切片的这个动作就已经完成了透化。组织切片中细胞的直径为 20 微米左右,而薄切片约为 4 微米,所以您已经完成了对组织中所有细胞的横切。如果您的切片更厚,或者您采用的是切片厚度通常为 40 到 50 微米的漂片操作,那透化就很有必要。在这些情况下,需要使用去垢剂进行透化步骤,这会在细胞和组织的细胞质膜上打孔,以便抗体接触细胞内的抗原。

如果您是免疫细胞化学实验,当对细胞内抗原进行染色时才需要通透。所以透化的目的在于为抗体构建接触抗原的通道,以便染色。如果是要染胞外蛋白,就不需要透化了,当然这只是对细胞培养物而言。对于组织切片,只有当切片比较厚,例如厚度大于 10 到 15 微米时,才有必要进行透化。

最后,建议 — 如果我的 IHC 实验没有任何染色结果,您的建议是什么?我们还会回答几个问题,这是我的最后一个问题。

BC: 对,这里有几个我可以回答的问题,Tom。好,第一个问题 — 什么是同型对照?这是个好问题。对于抗体而言,它是IgG 免疫球蛋白,您可以知道它的亚型和检测的靶标。而同型对照针对的是您的样本中不存在的抗原,通常来源于植物或化合物,理论上不与样本中的任意位点结合,至少是它的可变区不与任意位点结合。

但是,众所周知,IgG包括Fc 段,而偶联物如荧光素或酶可以结合这些区段。有时候,Fc 区会在样品中发生非特异性结合,因此您的一抗可能会产生一些非特异性信号,而这些信号来自于Fc区段而非目标蛋白。

所以,如果您使用同型对照,就能通过比较抗体的背景知道哪些染色是特异性的,哪些不是,而只是 Fc 区引起的。所以这对于流式细胞术或免疫组化实验中观测背景通常很有用。如果您使用的是荧光素直标一抗,您所用的同型对照也需要直接偶联相同标记,这一点很重要。您需要使用稀释度与一抗完全一致的同型对照,因为只有这样才能对比出样品中的非特异性染色。

另一个问题是:最好选用哪种封闭液?这是个好问题。一般来说,对于组织切片,如果您使用的二抗的 Fc 区可能会像我刚才提到的同型对照那样引起非特异性染色,您可以用某种血清封闭组织,BSA 也很常用。通过封闭,您能够限制抗体与样品发生结合的数量。

所以当您进行 IHC 实验时,您需要考虑这一点 — 如果选用血清封闭液,血清应来自制备二抗的物种。因此,如果您使用的是山羊二抗 — 例如山羊抗兔或山羊抗小鼠抗体,可以使用最高 10% 的普通山羊血清;如果您使用的是驴二抗,可以使用驴血清。另一种常用的封闭液是 BSA;一般使用 5% 的 BSA — 因为它是经过纯化的,因此用量比血清少一点。我们一般不使用牛奶作为封闭液,因为它更适用于蛋白质免疫印迹。因此,一般来说封闭液要么是血清,要么是 BSA。

另一个问题,嗯,我们在这里能够解答的问题很有限,无法一一详细作答。如果在 IHC 实验中没有获得任何信号,未得到任何染色结果,怎么办?你想回答下这个问题吗?

TR: 恩,好的。我正想说下这个问题:没有染色结果时我应该怎么办?这是个比较宽泛的问题。这种情况下,有可能是抗体有问题,或者您的实验方案中的某些试剂有问题,或者是实验方案本身有问题,但我们假设不是这些原因。还有一种可能是您研究的组织样品中不表达您要检测的蛋白质。您会发现很多蛋白质都有组织特异性,所以您需要确认是否可以达到预期的染色效果。如果您已知有某种经验证的阳性对照组织一定能够表达您的目标蛋白,那么您最好设法获取该组织的切片作为对照。如果是其他的情况,那就需要解决实验方案存在的问题,可能的原因包括:一抗有问题,二抗有问题,或者偶联到二抗的酶有问题。检查这些问题的方法是检查二抗的质量,确保它对同一物种的其他抗体有效。

但是,同样地,也有可能是因为蛋白质表达水平很低,在这种情况下就需要尝试不同的稀释系列。您在抗体的说明书表看到的推荐稀释度可能是 1:1000,但有可能对于您的特定制备组织样品来说,1:200 的稀释度可能效果更好。要记住这点。

BC: 还有一点需要牢记,我不知道之前是否提到过,那就是在做荧光染色时,应该对二抗 — 任何孔中的二抗,避光处理,因为它们会发生光漂白。然后,下一个问题是:如果组织中背景太多或者有不正确的非特异性染色,您建议怎么做?背景太多可能是 Tom 提到的自发荧光造成的。也有可能只是因为使用了过多的抗体。如果您使用了一抗和二抗,而组织样品中的蛋白表达量很高,就可能看到大量背景。您可以将稀释度再降一些,同样地,抗体说明书推荐的稀释度可能是 1:1000,但这可能不适合您的组织或样品。您也可以考虑,像 Tom 之前介绍信号放大时提到的,使用直接标记了 HRP 或荧光团的一抗,这样就不会有太多二抗引起的信号。如果产生了非特异性的染色结果,有可能就是抗体的 Fc 区结合导致的,这就是为什么我们推荐使用同型对照来进行比较,目的在于检查是否存在免疫球蛋白本身引起的非特异性染色。或者,也有可能只是因为抗体错误地与其他物质结合了。

如果您在做免疫细胞化学实验的过程中发现检测到的蛋白质位置不正确 — 例如您预计它应该在细胞质中,而您却在细胞核中发现了该蛋白质,这可能是由于抗体错误地结合了其他物质,或者也有可能是另一种原因...您需要查阅文献,有研究表明某些蛋白质可能会在细胞核进进出出,在细胞质和细胞核之间转移。或者,如果目标蛋白是膜结合蛋白,而表位恰好在细胞内的位置,您就有可能就在细胞质中看到它。所以您需要查阅一些文献,了解以前的研究成果,我推荐一个很有用的网站,叫做 UniProt,U-N-I-P-R-O-T,又叫 SWISS-PROT。这是个很好的资源,在这里您可以找到蛋白的氨基酸序列、定位等等。快 11 点了,还有很多问题,我想这些问题我们将在研讨会之后回答。我们可能会通过电子邮件回答您的问题,我想关于这一点 Vicky 可以更详细地为大家解释一下。那么,很遗憾我们没能现场回答每个人的问题,但我们很快就会与您联系。

TR: 对,我们会通过电子邮件跟进。

感谢 Brendan、Tom 和 Javier 今天为我们带来的讲座。就像 Brendan 和 Tom 刚才所说的,我们今天收到了很多问题,但很遗憾无法一一作答。问题没有得到回答的观众,我们随后会联系您,回答您的问题。如果您对于此次网络研讨会上讨论的内容有任何疑问或者有任何技术问题,我们的技术支持团队将非常乐于为您提供帮助,您可通过 cn.technical@abcam.com 联系他们。我们希望此次网络研讨会能够为您的研究工作提供一定的信息和帮助。我们期待并欢迎您参与今后的其他网络研讨会。再次感谢您的参与,祝您研究顺利!


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