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Webinar Optimize IHC/ICC through careful experimental design

免疫组化(IHC)和免疫细胞化学(ICC)实验结果优化网络研讨会

本次在线点播讲座由Abcam资深成像专家Simon Renshaw主讲,提供给您如何上手优化IHC和ICC实验的建议。

我们将手把手带您解决这些实验在设计上和操作上的误区。

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网络研讨会主题

  • 关于所用抗原的背景知识
  • 样本形式
  • 固定
  • 抗原修复
  • 检测体系
  • 用于分析的样本制备
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关于主讲人

Simon Renshaw, Abcam资深成像专家


网络研讨会解说词

嗨,欢迎参加 Abcam 网络研讨会。今天的主讲人是 Abcam 资深成像研究员西蒙·伦肖 (Simon Renshaw)。Simon 在英国布拉德福德大学修完生物医学学位。此后,在英国剑桥阿登布鲁克医院组织病理学部,他完成了 BMS1 培训。在那里他使用免疫组化 (IHC) 和免疫荧光 (IF) 技术进行了治疗目的的实验诊断。西蒙已经编辑和跟人合著了教科书《免疫组化:方法快讯》,近来为《免疫分析手册》即将出版的第四版写了一章有关 IHC 和 IF 的内容。2001 年,Simon 加入了 Abcam。

今天与西蒙一起的有 Abcam 产品经理朱迪丝·兰吉尼克 (Judith Langenic)。Judith 在邓迪大学取得了分子生物学学士学位和博士学位。一完成学业,朱迪丝就去英国剑桥的 MRC 分子生物学实验室,从事 DNA 损伤和修复研究。2011 年,朱迪丝加入 Abcam。

我们开讲之前,先简单提醒一下,可通过你电脑屏幕右下侧的问答面板随时提交问题,这些问题会在结束时进行解答。另外,当你退出这次网络研讨会时,界面就跳转至一个页面,在那里有一个讲义的 PDF 拷贝,可以下载。现在,就有请 Simon 开始今天的在线讲座。

大家好,欢迎大家参加Abcam 网络研讨会,题目是通过实验设计优化 IHC 和 ICC 的实验结果。顾名思义,我要讲讲在安排免疫组化或免疫荧光实验时必须考虑的重要因素,尽可能获得最佳结果。这些必须考虑的因素根据样本类型大致包括以下部分:固定、石蜡包埋、抗原修复、检测体系、对照、复染剂、样本制备。最后,我们会做个快速总结。

首先,我们需要对抗原有个清晰的概念,什么是抗原,之后我们也有很多地方会提到抗原。antigen是antibody generator 的简称,它被宿主的免疫系统识别为非我,即对于免疫系统来说,抗原并不是宿主的生物组成成分。宿主的免疫系统会针对抗原产生抗体,标记并破坏它。基本上任何东西都可以是抗原,例如病毒、细菌、花粉、某些化合物等。不过,抗体识别的是抗原上的一个特定区域,称为抗原表位。就蛋白而言,抗原表位是蛋白表面上的一小段氨基酸序列。这就是本次网络研讨会里所谈的 “抗原”。

我们还需要准确的定义 IF、ICCIHC 之间的差异。IHC 即免疫组织化学,是对组织切片上的某个抗原进行免疫学检测。ICC 即免疫细胞化学,是对细胞制片上的某个抗原进行免疫学检测。两者可使用相同的检测体系,来显示一抗的结合。标签可以是酶,催化底物产生有色沉淀物,也可以是荧光素。

IHC常用酶标记,ICC常用荧光标记。不过,这并不绝对,大多数情况下,两种标签都可用于 IHC 和 ICC 应用。IF 是免疫荧光,指采用了荧光标签进行免疫学检测。出于上述理由,谈到 IF,一般认为是指细胞免疫荧光。

优化免疫染色实验的第一步是正确认识您检测的抗原。看看哪些组织已使用抗体检测该抗原,哪些组织预计会表达该抗原。它是在正常组织中表达还是仅在某疾病中表达?它的表达是否具有性别特异性或种属特异性,或者仅在某一特定类群中表达?

类似地,我们看看实验室的哪个细胞系已使用抗体检测该抗原,哪个细胞系预计会表达该抗原?细胞是否需要特定的生长条件,如骨胶原,或者是否需要使用特定化合物处理来表达该抗原?细胞密度会影响抗原表达吗?例如,细胞接触会上调黏连蛋白的表达。哪种样本类型已成功检测过该抗原,石蜡切片、冰冻切片还是细胞制片?哪些物种已使用抗体检测该抗原?哪些物种预计会发生反应?抗原的亚细胞定位是什么?是否在细胞器特异表达?哪些固定剂已成功检测了该抗原?浓度和配方是什么?样本固定是怎样操作的?固定多久?什么温度?抗原修复是否是必要步骤?如果是,是热抗原修复还是酶抗原修复?是使用水浴、微波炉、还是压力锅?用到哪种缓冲液或酶?pH和配方是什么?在什么温度下进行的?多长时间?抗体的工作浓度或稀释比例是多少?最后,抗体来源于什么物种?

为了优化 IHC 或 IF 染色,必须回答上述所有问题。怎样去找到这些信息?如果可能,一定要从行业领先的公司购买抗体,它会提供优质的抗体和优秀的售后技术支持,例如Abcam 。

一般来说,抗体的数据表上的信息越多,使用者就对该抗体的特异性越有信心。但是,不是什么时候都能这样,那我们可以通过互联网来搜索一些信息。例如,单克隆抗体可以通过搜索克隆号找到使用该抗体的参考文献和图片。它们会提供所用组织、抗原修复和工作浓度的相关信息。在生物信息数据库上对抗原进行搜索,可以找到一些数据和信息,如组织表达特异性和亚细胞定位。这张幻灯片展示了几个例子。如果数据表上提供了免疫原的氨基酸序列,可以进行 BLAST 搜索,比对该抗原与不同物种的同源性,看看是否有发生反应的可能性。电话联系抗体公司的技术支持,也是很好的方法。

我们现在来考虑不同的样本类型。石蜡切片是组织经过固定、处理,然后石蜡包埋,切片。石蜡在切片时提供支撑,也称“超薄切片”。石蜡切片提供了保持形态与保护抗原性的最佳平衡。它们非常稳定,但在免疫染色前需要先进行脱蜡。如果是用交联性醛固定剂来固定,那么它们也需要进行抗原修复。石蜡切片通常 4 微米厚,如果切片厚度大于4微米,抗体可能会被困住,导致假阳性染色。

冰冻切片是新鲜组织被速冻后,在 OCT 中包埋。速冻通常使用液氮,可以降低冰晶产生。OCT 有利于切片,就像石蜡一样,在切片时为组织提供支撑。冰冻切片适用于不能用醛固定和石蜡包埋的抗原。因此,抗原呈现更天然的状态,但组织形态往往较差,不过,如果优化样品制备,可以将影响降到最低。比起石蜡切片,冰冻切片更脆弱,制备技术要求更苛刻,如果使用了醛固定剂,抗原修复的风险更大。通常,冰冻切片的厚度是 4–10 微米,跟石蜡切片一样,切片太厚,抗体可能会被困住,导致假/阳性染色。

漂片是冰冻或振动切片在合适的缓冲液中,直接进行免疫染色。这样就可以使用较厚的切片,厚度通常约 40 微米,没有支撑介质来困住抗体。比起冰冻切片或石蜡切片,漂片更难操作,因为免疫染色期间,它们没有固定在玻片上。神经领域科学家们很喜欢使用漂片。

细胞制片可以是常规细胞涂片,离心甩片,或是载玻片上的单细胞液基薄层。细胞系可以在载玻片小室、玻片或 96 孔板上生长。一般来说,它们与冰冻切片类似,但因为突变程度高,细胞系中抗原的表达与in vivo状态下相距甚远。例如,与宫颈涂片相比,HeLa 细胞的抗原表达差异较大。

现在让我们来看固定。免疫组化检测的组织,更具体来说是抗原,必需要保持与in vivo 状态下一致,这是通过固定来完成的。固定的目的是尽可能的保护细胞和组织组分,并且在之后的染色过程中不发生变化。它会阻止细胞自溶和细菌分解,稳定细胞和组织形态。常用的固定方法是将切下的组织浸泡在合适的固定液里,使其浸润组织。通过改变蛋白的三级结构的构象而使其失活。

有些抗原在组织离体后只能存在几分钟。一旦组织离体,它们就会经历自毁过程。这一过程叫自溶,在细胞死亡后,受酶的作用,发生蛋白降解和细胞液化。随后发生腐败,包括细菌对组织的分解,进一步促进抗原降解和组织形态破坏。

肝、脑、肾等富含酶的组织中,自溶更严重。需要记住的是,固定应当保护组织和蛋白。因此,它是免疫染色的第一步也是最基础的一步。如果一开始就没有抗原,免疫染色实验就没有意义了。

第一类常用固定剂是醛,又叫交联剂,如甲醛、多聚甲醛和福尔马林。醛固定是在相邻蛋白表面的赖氨酸残基之间形成共价亚甲基桥形交联。细胞质被转变成蛋白质凝胶状网络,使细胞固定保留在尽可能接近于in vivo 的状态。可溶性蛋白与不溶性蛋白形成共价键。细胞组分,如脂质、糖类和核酸,均不发生交联,而是被困于交联网络中。谨记,尽量使用中性福尔马林,以免甲醛与红细胞中的血色素发生酸性反应,形成福尔马林色素,该色素呈深棕色或黑色,与 HRP/DAB 染色类似。戊二醛往往仅用于电镜检测的组织,虽然交联程度高有更好的形态,但抗原遮蔽程度太深而不适用于一般用途。

第二类常用固定剂是蛋白变性剂,又称为沉淀剂或凝聚剂,如醋酸、甲醇、乙醇和变性乙醇。蛋白变性剂会破坏内部疏水键,从而改变蛋白的三级构象。由于氢键不受影响,二级结构得以保留。它不像醛固定剂,不会形成共价交联,没有必要进行抗原修复。适用于对醛固定敏感的抗原。糖类抗原,如膜结合表面抗原,常用乙醇固定,因为乙醇使糖类沉淀。不过,乙醇固定可能会阻碍 CD 分子的染色。

冰冻切片通常在 70% 至 95%的乙醇中固定 10 至 30 分钟,以减少细胞核形态扭曲和胞浆收缩,若用无水乙固定,会看到这类现象;同理,也可用醋酸和甲醇或乙醇的混合液。醋酸还有助于乙醇在组织内的渗透。乙醇和丙酮对组织的渗透较差,一般仅用于组织切片或细胞制片,并不用于组织块。值得一提的是,并没有通用的固定剂,只有最合适的固定剂,才能理想地保存目标抗原。

附带说一下,还有其它一些不太常用的固定剂,如高碘酸盐–赖氨酸–甲醛、Bouin 固定液、丙酮、B5、Zenker 固定液和锌福尔马林。这些固定剂是在特殊情况下使用。在此我不一一详述,如果您想了解更多信息,请参阅这张幻灯片上的表格。

固定剂的选择非常关键,这张幻灯片上展示了一个实例。这是细胞免疫荧光的图片,我们使用Abcam ​的alpha-tubulin抗体, 货号ab7291HeLa 细胞进行染色,二抗用的是驴抗小鼠 Alexa Fluor ® 488,货号ab150105。抗原是细胞骨架蛋白。在甲醛固定的细胞中,染色模式并非清晰分明,但甲醇固定的细胞则有很好的表现。

我们来讨论一下影响固定程度的因素,这是一个重要考虑方面。不能固定不足,也不能固定过度,实际上就是在良好的组织形态与保护抗原性之间有个很好的平衡。有三个因素:第一是固定剂的渗透性,渗透组织要快,以便于快速保存抗原。使用尽量小的样本,确保完全浸润。推荐组织块尺寸小于 1 x 1 x 0.4 厘米。第二,固定剂浓度,浓度越大,固定程度越深。最后是固定的时间和温度,时间越久,温度越高,固定程度越深。

上述尺寸的组织块至少应固定 3.5 小时,但不长于 24 小时。时间越长,形成的亚甲基桥程度越深。固定不足会导致组织形态不佳,抗原不能很好地保存。而固定过度的形态虽然很好,但亚甲基桥交联程度深,抗原遮蔽度也较高。这些亚甲基桥的交联会形成一个屏障,阻止抗体结合。因此在免疫染色前必须先进行抗原修复。由于化学反应都受到温度影响,温度越高,亚甲基桥形成越快。对于组织块,甲醛在室温下固定 18–24 小时,可以很好地平衡良好的组织形态和保护抗原性。

对于未固定的冰冻切片,室温下甲醛固定 10 分钟是合适的。由于切片厚度仅约 4 微米,渗透不是问题。固定十分钟的交联度适当,而不会出现固定过度现象,因为比起石蜡切片,冰冻切片在抗原修复后可能会损伤或脱片,更不用提细胞制片。对于组织切片,甲醛的浓度通常是 10%,而细胞制片是 4%–10%。对于冰冻切片和细胞制片,乙醇和甲醇的常用浓度是 10%–95%,以减少细胞核形态扭曲和胞浆收缩,若用无水乙固定,会看到这类现象。

对于冰冻切片与细胞制片,蛋白变性剂和丙酮固定 5–10 分钟就可以了。冰冻切片可在室温下固定。而细胞制片,应使用预冷的的蛋白变性剂或丙酮在负 20°C固定,防止细胞解离。使用 100%丙酮固定的冰冻切片往往较脆,核膜消失,形态发生变化。因此在固定前,可以让冰冻切片干燥过夜,并且在染色前再干燥 10 分钟。我们需要注意的是,建立并坚持严格的固定方案十分重要,有助于增加抗原性,提高结果的可重复性。

接下来我们来看看组织处理。接下来两张幻灯片仅适用于石蜡包埋组织,关于抗原性的这个话题很值得考虑。甲醛固定后将要进行石蜡包埋的组织块需要经历从水相到有机相的过渡,使得石蜡可以浸润组织。而组织处理会影响抗原性。组织处理大约需要 12 小时,其中8 小时是过梯度乙醇,二甲苯 2 小时,浸蜡 2 小时。

乙醇本身是一种蛋白变性固定剂,本身会进一步影响某些抗原的抗原性。同时,它会完全除去组织中的脂质。后期处理在 6°C 左右进行,也会降解一些抗原。总之,组织处理后,有些抗原无法保存的很好,或者根本无法保存。这样的情况下,冰冻切会更加合适,因为不需要进行这样程度的组织处理。我们需要注意的是,建立并坚持严格的固定方案十分重要,有助于增加抗原性,提高结果的可重复性。

现在,让我们来讨论抗原修复。抗原修复断开相邻蛋白之间的亚甲基桥,去除醛固定带来的抗原遮蔽效应,使得抗体接触抗原表位。当然,抗原修复仅适用于醛固定样本。因此,如果在免疫染色前不进行抗原修复,染色信号会很弱,甚至完全染不上。常用的抗原修复方法有两种:热诱导抗原修复,简称 HIER,将组织切片浸没在合适的缓冲液里,如柠檬酸三钠 (pH6) 或 EDTA (pH9),通过压力锅、水浴、微波炉或其它自动化平台加热。另一种是酶抗原修复,将组织切片浸没在合适的酶液中,如胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶或蛋白酶 K。

影响抗原修复程度的因素有几个:一个是抗原修复时间,时间越长,抗原修复程度越深。哪怕 2–3 分钟的差异,可能会显著影响到随后的免疫染色强度,且抗原修复时间的增加会增加背景染色。

第二个因素是温度,如果可能,最好将温度保持在刚好沸点以下,因为沸腾可能会引起脱片。采用包被的载玻片,如APES 或多聚赖氨酸包被,加上科研用微波炉和自动化平台多有温控装置,有助于防止脱片。温度越高,抗原修复的程度越深。酶抗原修复时,反应有最适合的温度,如果温度发生变化,会影响抗原修复的程度。

修复液的配方和 pH 也有影响。某些抗原适用于一种抗原修复液而其它的并不适用。酶抗原修复时,反应有最适合的pH,当这个条件发生改变也会影响抗原修复的程度。

不同的抗原修复方法也会带来差异,一些抗原适用于酶抗原修复,而另一些抗原适用于热抗原修复。而在热抗原修复时,不同的加热方法也会影响抗原修复的程度。例如,微波炉有不同的额定功率,满功率运行时,一定时间内的抗原修复程度也会不同。家用微波炉加热不均,组织放置的位置不同,抗原修复的程度也会不同。另外,一致性是获得可重复性结果的关键。

亚甲基桥的交联程度也是因素之一。样本的醛交联程度越深,则一定时间内的抗原修复程度较低。这再次证明了固定方案的一致性非常重要。

抗原对于亚甲基桥交联的敏感性也需要考虑到,某些抗原似乎完全不需要抗原修复,而有些抗原需要抗原修复的程度很深。这是由于抗原表位的氨基酸序列和在蛋白三级结构中的位置。

值得一提的是,没有通用的抗原修复液。我们可以通过预实验,找到最合适的抗原修复液或酶,以及pH、抗原修复的方法与时间。

现在,我们来讨论检测体系和报告标签。简言之,检测体系结合一抗,使得一抗与抗原的结合可视化。常用的几个检测体系,可提供不同程度的信号放大。不管是哪一种,都涉及到报告标签的使用,使得我们可以借助适当的显微镜观察到样本信号。报告标签要么是酶,要么是荧光素。

酶报告标签在遇到相应色原时,会在一抗结合位点处产生稳定的有色沉淀。最常用酶报告标签有两个,辣根过氧化物酶(简称 HRP)和碱性磷酸酶(简称 AP)。二者各有常用色原, HRP 有 AEC、DAB 和含镍 DAB 等色原;AP 有固蓝、固红和新品红等色原。表格中可以看到,不同组合的酶和色原会产生不同颜色的沉淀物。请注意,一些沉淀物是醇溶性的,在封片时有重要意义,我在后面将谈到。

选择酶报告标签后,需要考虑到组织内源存在的酶。血红细胞中有内源性的过氧化物酶,会与 HRP 色原发生反应,产生假阳性染色,而在切片上孵育过氧化氢溶液,可以很好的进行封闭。类似地,大肠表达内源性碱性磷酸酶,在切片上孵育左旋咪唑溶液,可已很好的进行封闭。不过,这种情况下更好的解决方案是使用 HRP替代 AP。

荧光标签,又称为荧光素或荧光基团,可以吸收一定波长的光然后发射较长波长的光。这里有几个常见的例子。可以看到,每个标签都有不同的激发波长和发射波长。在这里,建议您采用第二代荧光标签,如 Alexa Fluor® 系列,因为它们有更好的荧光强度,并且较之 FITC 更不容易发生光漂白。

荧光标签的选择取决于显微镜的滤光片组和复染试剂。需要确认的是,荧光素和复染试剂的吸收光谱和发射光谱不重叠,并被单独激发和观察。可以使用光谱分析程序,帮助核查并确保无光谱重叠,且与滤光片组兼容。

我们常常会碰到这个问题,使用荧光标签还是酶标签?酶标签常用于组织切片,而荧光标签常用于冰冻切片和细胞制片,但是并不绝对。我们应该根据实验设计来选择合适的检测系统。相较而言,荧光标签最大的优势是,可以单独观察每个荧光通道,也可以将它们重叠成伪彩图片。因此,不需要特殊软件就可以看到信号的共定位。而染色较弱的通道也可以很好的观察,不会影响到其它通道。

因为一些组织成分,如骨胶原,组织切片会有自发荧光。甲醛固定也会产生自发荧光。当自发荧光太强时,会遮蔽荧光标签的信号。因此,组织切片更适合酶法检测。细胞制片和冰冻切片固定的时间较短,不足以产生自身荧光,且细胞样本往往并没有自发荧光的组分。

比起直标一抗,可以进行信号放大的检测方法总是更好的。这使得我们可以观察到表达较低的抗原。信号放大通常涉及带标记的二抗,该二抗识别一抗种属与亚型。通常一个一抗上会结合多个二抗,增加标签数量,使得信号更强。二抗可以直接带酶标或荧光标记,也可以带生物素标记,即亲和素/生物素复合物,亲和素上偶联标签,简称 ABC法。

这些都是常见的信号放大方法,每种方法的实验步骤不尽相同。其中,葡聚糖聚合物、紧凑型聚合物和 ABC法的信号放大效果最好。

现在让我们详细讨论每一种方法。间接法是使用带标记的二抗结合一抗。只有两步,先一抗孵育后二抗孵育,操作简单。内源性生物素不成问题,因为该检测系统不使用生物素。当然,比起聚合物法或 ABC 法,它的信号放大程度较低。不过,适用于大多数抗原,特别是荧光标签。

ABC法,是使用生物素偶联二抗结合一抗,然后用带标记的亲和素来结合二抗。它的信号放大强度与聚合物体系的相当,但是操作步骤是三步,较之其它方法慢。另外,内源生物素可能会产生背景,需要适当的封闭。最后,ABC 法提供的亲和素和生物素标记复合物是分开提供的,使用时必须将二者混合形成ABC复合物后,再加到染色样本上。而ABC 复合物的形成需要约 30 分钟,增加了免疫染色的实验时间。值得一提的是,比起亲和素,使用链霉亲和素的背景更干净,因为亲和素带正电荷,而链霉亲和素几乎是中性的,所以链霉亲和素的静电结合作用较小。

葡聚糖聚合物检测系统,是将带标记的葡聚糖聚合物偶联在二抗上。它是两步法,实验操作更快。而内源性生物素也不是问题。葡聚糖聚合物的信号放大强度显著高于直接标记的二抗,因为葡聚糖骨架上可以偶联多个标签。然而,由于葡聚糖较大,在对某些细胞内抗原进行染色时,会因空间位阻而信号减弱。

最后,我们有紧凑型聚合物系统。它是标签分子彼此共价结合,直接偶联在二抗上。如同葡聚糖聚合物系统,紧凑型聚合物系统也是两步法,操作更快,且没有内源生物素背景。较之直接标记的二抗,信号放大效应更大。但更重要的是,紧凑型聚合物比葡聚糖聚合物系统小得多,不会因空间位阻产生干扰。因此,该系统几乎没有缺点,是最优选择。

接下来让我们看看对照。免疫染色实验中,必须设立对照。没有合适的对照,就无法正确解读染色信号。它可以让我们确认观察到的染色模式是真实、准确和可靠的。

一般对照有两类:一类是抗原对照,包括抗原的阳性对照和阴性对照。阳性对照是已知表达待检抗原的样本,因此,阳性对照是应该有阳性信号的。在免疫染色时,将阳性对照和待测样本同时进行实验,且处理方式一致,以确认整套方案是否有效。针对这两种情况,我们可以使用阳性对照:

一是不清楚待检样本是否表达该抗原时,可以使用已知表达的抗体检测过的组织作为阳性对照;另外,对于定制抗体,我们在检测其特异性时,与其它抗体一起来染阳性对照。

阴性对照是已知不表达待检抗原的样本,染色结果应该是阴性。如果在阴性对照中观察到信号,则可能是一抗有非特异性结合、检测体系有问题,或者源于待检样本的特殊性状。

另一类对照是试剂对照,确保染色信号是来源于一抗与抗原的结合,而不是检测系统或样本所产生的背景。不加一抗的对照就可以很好的来鉴别检测系统或样品产生的假阳性染色。

我们再来看看复染剂。复染剂对特定的细胞结构进行染色,增加染色对比效果,明确细胞或亚细胞定位。复染剂可以是着色性或荧光性的,与检测系统匹配。对酶检测系统而言,常使用核复染剂。而免疫荧光,常用核复染剂和质膜复染剂。它们的颜色或荧光通道必须与检测系统不同,因而信号可以相互区分开来。酶检测系统常用苏木精作核复染剂,包括进行性或退行性,反蓝后变成蓝紫色。这张幻灯片的右上图可见苏木精染色的一个例子,棕色信号是DAB 染色。

其它的常用核复染剂还有浅绿、固红、甲苯胺蓝和亚甲基蓝,分别将细胞核染成绿色、红色或蓝色。需要注意,如果待测抗原定位在细胞核,需要确保核复染信号不会太强,否则会遮蔽阳性信号。

对于荧光检测系统,复染剂可以是DAPI染细胞核,也可以是荧光素如Alexa Fluor®偶联凝集素染细胞膜。这两种荧光复染剂的图片见幻灯片右下图。在选择荧光复染剂时,需要确认显微镜的滤光片是否匹配。

最后,我们来进行显微镜观察。为了很好的保护样本与染色结果,可以长期储存,并提高成像质量,我们需要对样本进行处理。即使用适当的封片剂,并用盖玻片盖住样本。水溶性封片剂适用于荧光标签和酶标签,有机封片剂仅适用于酶标签。有机封片剂干后偏硬,可以使盖玻片牢牢封住样本,保持在原位。

有机封片剂的折光率较好,例如,DPX 在镜下成像非常清晰。但是,需要确保酶标签与底物反应产生的有色沉淀与有机封片剂兼容。例如,HRP 与 AEC 的反应产物是醇溶性的,如果使用有机封片剂,有色沉淀会在脱水和分色的过程中消失。

荧光标签常用水溶性封片剂,可以用 10%的甘油,但是含有抗荧光猝灭剂的商业化封片剂会更好。对于免疫荧光,建议在空白的盖玻片上滴上封片剂观察,确保它不产生任何自发荧光。

我们来小结一下。在免疫染色时,对于每种抗原,都需要优化操作步骤,认真设计试验;了解实验变量,染色结果预期是什么样子,需要什么对照组,务必确定免疫染色方案中是否有兼容性的试剂或操作。

多谢各位于百忙之中来听我的这次网络研讨会上。现在朱迪丝会给大家介绍Abcam的实验解决方案。

JL:谢谢西蒙,大家好。我愿借此机会给大家讲讲有关 AbcamIHC/ICC 资源和产品,帮助您优化细胞成像实验。

兔单抗 RabMAb 拥有高亲和力和高特异性,染色的灵敏度高且背景低。这使得它们特别适用于要求严苛的应用,如福尔马林固定石蜡包埋组织的 IHC 分析。RabMAb 经过组织芯片 IHC 检测或多样本 ICC/IF 检测,可提供最佳结果。RabMAb 还提供人和小鼠蛋白靶标的多种表位识别,所以无需额外替代抗体。鉴于 RabMAb 是兔抗,特别适用于小鼠或大鼠组织样本。RabMAb 也适合与小鼠或大鼠单抗配对,进行同步染色。想了解更多信息,请访问 abcam.cn/RabMAbs

对于 RabMAb 染色,我们推荐最新推出的 Alexa Fluor® 偶联二抗。这些二抗偶联了 Alexa Fluor® 488、555、594 和 647。Alexa Fluor® 偶联二抗在 Abcam 实验室经过广泛测试,确保明亮的染色和较低的背景。预吸附抗体的选择范围较大,可以保证那些抗体之间没有交叉反应。所有产品的稀释度介于 1/200 和 1/1000 之间。

Abcam 的产品目录包括一系列细胞成像工具,可用于多重染色。我们的 CytoPainter 系列试剂盒,可用于肌动蛋白丝、线粒体和溶酶体的多重染色。它是一个简易的共定位研究方法,不必在多个抗体上浪费时间。CytoPainter 试剂盒可以跟二抗和核染料组合使用。举个例子,请看右上角所示的小鼠胚状体的 IHC 图像。

想得到出色的核染色,何不试一下远红外染料?染色不到五分钟即可。本系列有 DRAQ5 和 DRAQ7,可用于活细胞或固定后细胞的染色。下图中,细胞核是用 DRAQ7 染的,蓝色源于 AMCA 偶联二抗。

针对细胞成像,我们有广泛的二抗产品组合已经过验证,包括Alexa Fluor ®偶联二抗和预吸附二抗,最小化交叉反应。我们还有用于光谱显微镜的 Chromeo 偶联二抗、用于高分辨率电子显微镜的 AbGold 偶联二抗。为了增大 IHC 实验中的组织渗透度,我们建议您试用F(ab’)2 系列抗体。

对于酶法检测,Abcam 也有全面的 IHC 产品系列。产品组合包括 EXPOSE IHC 试剂盒,其灵敏度大于聚合物检测体系和 ABC 检测体系。这是通过一种较小的检测复合物实现的。除了各种试剂以外,我们的 IHC 产品组合还包括经典的生物素和链霉亲和素试剂盒。关于我们的细胞成像产品,如果你想知道更多详情,请访问 abcam.cn/Imaging。这个页面上,你可以找到更多详尽信息,还可以放大查看图像。

使用小鼠抗体检测小鼠组织的时候,常遇到问题,背景水平高。这是因为二抗结合了内源性小鼠  IgG。我们提供的小鼠对小鼠 IHC 检测试剂盒就能解决这个问题。这种聚合物型检测试剂盒含有一种封闭剂,可封闭内源性小鼠 IgG,保证背景尽可能低,并使检测方案简单可靠。该产品的更多信息可见 abcam.cn/MoM

Abcam 技术支持团队会尽力回答您提出的任何问题。团队成员擅长多种语言,可提供法语、西班牙语、德语、中文和日语等多语种支持。您可以在美国、英国、香港和日本联系他们。

露西在介绍里提过,西蒙编了一本关于免疫组化的书,更详尽地叙述了这次网络研讨会期间所讨论的许多话题。所以,如果你想获取更多深入的关于抗原修复方法、报告基因标签的选择和实验的自动化的信息,那么这本书是个很棒的资源。这本书可直接通过 Abcam 网站或亚马逊网上购买。

本学年期间,Abcam 还组织了多个会议。其中,你或许会对“脑修复的新途径:中枢神经系统的编程和重新编程”感兴趣的。这次会议将于六月份在美国哈佛大学举行,有关它的更多信息,你可以在我们的网站上找到。

接下来的六月份,在丹麦的哥本哈根,将举行染色质复制和染色体稳定性系列会议的第三次会议。主旨演讲人是瑞士巴塞尔弗雷德里克-米歇尔研究所所长苏珊·噶塞 (Susan Gasser)、英国苏格兰爱丁堡大学布坎南遗传学教授艾德里安·伯德 (Adrian Bird)。如果你有兴趣参加,请看看以下链接。

另外,我想着重讲一下我们后期开讲的在线讲座。如果你能在 1 月 31 日参加我们关于流式细胞仪补偿的一次网络研讨会,那我们会很高兴。这次网络研讨会的主持人是英国诺丁汉特伦特大学副董事格雷厄姆·颇克利 (Graham Pockley) 教授、英国纽卡斯尔大学流式细胞仪实验室主任伊恩·迪米克 (Ian Dimmick)。

另外,如果你喜欢这次网络研讨会,想更多地了解单标记和多标记 IHC,请登记参加 3 月 6 日西蒙的下一次网络研讨会。

要继续关注荧光主题的话,2 月 28 日有一个关于荧光蛋白质印迹法的网络研讨会。届时的网络研讨会将由英国伦敦国王学院马汀·布罗德斯托克 (Martin Broadstock) 博士主持。你可以访问 abcam.cn/webinars,听到我们所有的网络研讨会。

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