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细胞死亡的代谢调控网络研讨会

观看由 Cristina Muñoz-Pinedo 博士带来的网络研讨会。

了解细胞死亡与细胞代谢的相互作用,以及癌症和局部缺血环境下的细胞死亡机制。

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​​网络研讨会主题:​

  • 细胞死亡与细胞代谢之间的交互作用
  • 靶向代谢消灭癌细胞
  • 代谢应激诱导的细胞死亡
  • 缺血性细胞死亡

​​关于演讲者:​​

​​Cristina Muñoz-Pinedo 于西班牙格拉纳达的西班牙国家研究委员会 (CSIC) 取得硕士学位,主要研究的是葡萄糖对死亡受体诱导的细胞凋亡的调控机制。她在拉霍亚过敏和免疫学研究所 Doug Green 的实验室及圣犹达儿童研究医院完成了博士后培训。​

自 2006 以来,Cristina 一直担任西班牙 Bellvitge 生物医学研究所(IDIBELL,西班牙巴塞罗那)分子肿瘤学部细胞死亡调控研究团队的负责人(西班牙巴塞罗那)。她的团队主要研究在癌症和脑局部缺血环境下,营养物质缺乏导致细胞死亡的原因和方式。


网络研讨会记录:

CM:感谢 Abcam,以及在清晨或傍晚参加这次网络研讨会的听众们。我今天演讲的主题是细胞死亡的代谢调控。

这是本次演讲的大纲,我将从多个不同的方面介绍细胞死亡与代谢之间的交互作用。例如,我将介绍细胞死亡阶段代谢失活的机制,尤其是在细胞凋亡过程中。我还将简要介绍代谢或营养物质、或细胞代谢状态、细胞活力水平如何改变细胞死亡的途径。另外我还会介绍如何靶向代谢途径以消灭癌细胞。关于细胞死亡机制,我会提及一些相关的数据。其他内容还包括细胞营养缺乏及其如何根据不同的细胞类型诱导不同的细胞死亡方式;还有几张关于脑细胞局部缺血性死亡的幻灯片。

那么,什么是细胞死亡?关于细胞死亡,您可能已经了解我们研究较多的细胞凋亡过程,它是细胞死亡的主要过程,并且主要由半胱天冬酶诱导。这表示凋亡是一种调控形式的细胞死亡,该过程受到能够分解细胞的半胱天冬酶的调控。另一方面,还有另一种形式的细胞死亡 — CICD,这是一种不依赖半胱天冬酶的细胞死亡形式,但是它的调控蛋白与细胞凋亡相同,也是属于 Bcl-2 家族的蛋白。但是由于某些原因,半胱天冬酶无法被激活,当然这是对有丝分裂之后的组织而言。以前我们将原因不明的任意形式的细胞死亡都称为“坏死”,最近有研究表明,此类细胞死亡是由某些蛋白质介导的。据此我们能够定义若干坏死形式,例如之前曾举办过相关研讨会的程序性坏死,这是一种由 RIP 激酶诱导的细胞死亡形式。另一方面,坏死还可由线粒体通透性转换孔诱导,这在某些局部出血情况下非常重要。还有一种细胞死亡形式叫做自噬性细胞死亡,这种形式对于果蝇的发育非常重要,并且有研究表明哺乳动物细胞中也存在这种形式的细胞死亡;但我今天将不会介绍相关内容。

什么是凋亡?凋亡是细胞死亡的一种形式,在细胞培养中可见明显的形态特征,即生物膜空泡化和细胞裂解。从生化角度来看,细胞凋亡有两条主要途径:一条是死亡受体途径,在该途径中,TNF 等死亡受体通过与配体的相互作用发生聚集。然后聚集体会聚集一种传导分子 — FADD,用以激活半胱天冬酶。但在本例中,FADD 激活的是半胱天冬酶 8,它不会直接杀死细胞,而是通过激活下游的执行半胱天冬酶来发挥作用,例如半胱天冬酶 3 或半胱天冬酶 7。另一方面,您所能想到的各种刺激因素,例如生长因子水平下降,又或者是 DNA 损伤或任何其他形式的刺激,都会激活 Bcl-2 家族的蛋白,从而诱发线粒体途径。众所周知,BH3-only 蛋白或 Bcl 2 家族可激活在线粒体外膜上形成孔洞的 Bax 和 Bak 蛋白,它会诱发线粒体途径,而这一途径会导致细胞色素 c 释放,进而激活凋亡体和起始半胱天冬酶 9。同样地,杀死细胞的并非半胱天冬酶 9,而是半胱天冬酶 3。

目前已经知道两条主要的信号通路能够诱导细胞凋亡,与我们体内每天的细胞数量或者疾病中的细胞数量息息相关。线粒体通路是其中的一种,该通路受到BCL-2家族蛋白的调控。让我们回顾一下这些蛋白是如何工作的。Bcl-2、Bcl-xL 和 CL-1 是抗凋亡蛋白,能够将Bax和Bak保持在未激活状态。当然这只是用于说明的简化模型,实际上 Bcl-2 家族的蛋白之间会发生非常复杂的相互作用。激活的 Bax 和 Bak 蛋白能够形成导致细胞色素 c 释放的孔洞。当我们提到只含BH3蛋白的时候,可能指的是bid,也可能是Bim、Puma、Bik、Noxa,我们现在已经知道很多只含BH3的蛋白他们能够抑制抗凋亡蛋白的活性,从而解放 Bax 和 Bak 蛋白并直接将其激活,进而形成孔洞并释放细胞色素 c。

那么代谢是如何与细胞死亡联系起来的呢?几年前,Green 实验室研究发现,在凋亡过程中线粒体是主动失活的。一方面,如您所知,线粒体释放细胞色素 c 是细胞凋亡的线粒体途径的开端。这会影响呼吸作用,但这是一种长期影响。在短期内,释放了细胞色素 c 的线粒体仍然可保持正常功能一段时间。因此一旦细胞色素 c 的释放激活了半胱天冬酶,半胱天冬酶将回过头来裂解呼吸链中的一种名为 p75 的特定底物,进而使线粒体失活。所以,导致线粒体膜电位下降的实际上是半胱天冬酶,而细胞还能保持呼吸一段时间的原因是半胱天冬酶受到了抑制。实际上是半胱天冬酶产生了线粒体活性氧,呼吸作用受损。

具体过程是这样的:细胞通过呼吸链获取ATP,半胱天冬酶一旦被激活,就将裂解底物。Green 实验室的 Jean-Ehrland Ricci 曾分离出了复合物 1 中的底物 p75,在那之后线粒体就停止了呼吸作用。但这并非只是凋亡形式的细胞死亡过程中出现的某种现象而已,该现象对于我们研究细胞死亡的机制,或更确切地说,细胞的死亡速度有着非常重要的意义。

接下来您看到的是 HeLa 细胞的视频,该示例中的 HeLa 细胞正在表达我上面已经提到的呼吸链中的 p75 蛋白。绿色部分是连接了 GFP 的细胞色素 c,位于线粒体的内部,并且将在凋亡过程中从线粒体中释放。为诱导细胞凋亡,上述细胞经过了放线菌素 D 处理,我们检测了几次,结果都相同。细胞色素 c 释放后,我们可以看到细胞接触并结合能够结合磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白,然后细胞膜完整性被破坏导致碘化丙啶穿过细胞膜进入细胞。在这里我们可以看到细胞如何释放细胞色素 c,以及细胞结合膜联蛋白并吸收碘化丙啶的情况。这是加快播放的视频,实际上该过程要花几个小时的时间。但如果这些细胞表达的 p75 蛋白不会被半胱天冬酶裂解,从而线粒体不会失活呢?这种情况下,线粒体会保持呼吸,细胞尝试以其他适当途径死亡,但用时要长得多。所以即便是同时释放了细胞色素 c,后者也需要更长的时间来结合膜联蛋白和膜,因此细胞膜也将在更长的时间内保持完好。也就是说,细胞凋亡的正常发生需要使细胞内的线粒体代谢失活。

线粒体代谢并不是凋亡过程中唯一发生变化的代谢途径,Jean-Ehrland Ricci 实验室的研究还表明,半胱天冬酶还会通过裂解糖酵解途径中的蛋白使糖酵解失活。而我所提到的这另一种细胞死亡类型也是受 Bcl-2 家族的蛋白调控,属于非半胱天冬酶依赖性细胞死亡。当然,当 Bax 和 Bak 蛋白以同样的方式打开线粒体并使这些细胞死亡之后,我的意思是,使线粒体释放其内含物之后,细胞色素 c 仍能保持线粒体跨膜电位而细胞也能够继续呼吸一段时间。但细胞最终还是会死亡,并且这种情况下的非半胱天冬酶依赖性细胞死亡是细胞无法继续呼吸导致的。因此呼吸抑制在凋亡中很常见,在 CICD 中也是如此。

另一方面,我们还发现存在逆效应,也叫反效应,即通过细胞的代谢状态调控细胞死亡。许多团队的研究结果都表明细胞的代谢或代谢状态,或者细胞生长基质中营养物质的含量,都能够改变、调控多种细胞死亡途径。例如,强制糖酵解能够维持抗凋亡蛋白 Mcl-1 的水平,使细胞不被降解。与此同时,Noxa 也受到抑制,这就意味着细胞在强制糖酵解时生存状态更理想。另一方面,当基质中葡萄糖含量不足时,细胞能够诱导产生多种 Bcl-2 家族的杀手蛋白,例如 Bim、Puma 和 Noxa,或者激活 Bad,以杀死细胞或者至少使其处于一种更趋近死亡的状态。另一方面,葡萄糖剥夺还可通过死亡配体改变细胞死亡的方式。至少在某种程度上,由于 Flip 蛋白因降解失活而敏感性不足,因此它无法阻止细胞合成死亡诱导信号复合体。

葡萄糖不足时,细胞将维持 Mcl-1 水平并调控部分 Bcl-2 家族蛋白,从而变得对药物敏感,同时也对死亡配体敏感。

这是我们很早之前进行的实验,在该实验中,我们发现,在糖酵解抑制剂 2-脱氧葡萄糖存在的条件下,使用死亡配体处理会使更多的造血细胞死亡。这种抑制剂可影响糖酵解以及其他作用,细胞在存在该抑制剂的环境下培养时会变得更加敏感,即更容易发生死亡配体诱导的细胞死亡,而几乎可耐受这些死亡配体的细胞在使用 2-脱氧葡萄糖阻断其糖酵解代谢时则会转化为敏感细胞。

实际上,在死亡受体聚集的早期阶段就已经开始产生上述影响了。因此在 2-脱氧葡萄糖存在的条件下培养细胞,或者在效果相同的无葡萄糖存在的环境下培养细胞,细胞在与死亡配体共同培养的极短时间内即可形成大量复合体。膜中形成的复合体包含 Fad 和半胱天冬酶 8,因此细胞从最开始的第一步就已经做好了死亡准备。如您所见,在没有葡萄糖的条件下培养细胞能够加速细胞中死亡受体途径激活半胱天冬酶 8、激活半胱天冬酶 3 以及释放细胞色素 c 的各个阶段,当然,前提是使用死亡配体处理细胞。当然,对于许多死亡配体以及在多种细胞类型中,正如 Jean-Ehrland Ricci 实验室的研究成果所述,Mcl-1 含量低的细胞也能加速死亡配体诱导的细胞死亡。

另一方面,这些是不久前的研究,使用了与之前相同的造血细胞 — U937 细胞。这些细胞在无葡萄糖的条件下培养时,由于某种尚不明确的原因,它们对依托泊苷或氟脱氧尿苷等基因毒性药物的耐受性增强,其中氟脱氧尿苷是一种氟尿嘧啶的衍生物,能够抑制胸苷酸合成酶。因此细胞对氟脱氧尿苷的敏感性降低,如您所见,在上述条件下细胞色素 c 的释放量更低。所以基质中是否含有葡萄糖能够以很多方式改变代谢。代谢中涉及很多途径,但仅凭葡萄糖代谢途径就足够调控细胞死亡进程中的多种分子。

我想你们中许多人参加该研讨会的原因是你们对能够杀灭癌细胞的靶向代谢感兴趣。这是一个新的领域,同时也由来已久,自 Otto Warburg 的研究以来我们一直在寻找目标代谢,因为癌细胞的代谢不同于非增殖性细胞。

这里对上述代谢进行了总结,当然,这是一张超简化的示意图,您可以想象实际上有数千种代谢酶,而这里总结的是增殖性细胞和肿瘤细胞的代谢。与非增殖性细胞相比,这些细胞要消耗大量葡萄糖;其中一部分葡萄糖以乳酸盐和类似厌氧代谢的代谢途径经过衍生化之后被释放到基质中。其中一部分确实会进入线粒体,肿瘤细胞的线粒体代谢效率不高。肿瘤细胞仍然能够呼吸并利用线粒体生产脂肪酸,也就是说,许多癌细胞能够从头合成自身所需脂质和脂肪酸,以葡萄糖为原料合成它们需要的新物质。当然,某些癌细胞仍是从基质中获取所需物质,但另一些癌细胞则是自己合成新物质。肿瘤细胞还能够通过磷酸戊糖途径消耗大量葡萄糖,合成核苷酸。这些细胞增殖非常快,当然也就需要大量核苷酸。部分核苷酸可通过基质获得,而另一部分则是细胞自身以葡萄糖和某些氨基酸为原料合成的。可想而知,肿瘤细胞需要大量氨基酸,而其中谷氨酰胺对于多种谷氨酰胺依赖型癌细胞来说尤为重要。毋庸置疑,谷氨酰胺可用于蛋白质合成,但它也可作为线粒体中的代谢底物。癌细胞与非增殖性细胞之间的区别在于,癌细胞利用葡萄糖、谷氨酰胺和营养物质来合成更多生物质,而不是按照我们所研究的代谢途径那样生成更多 ATP,在这种代谢途径中,葡萄糖主要用于在线粒体中通过呼吸和三羧酸循环生成 ATP。癌细胞需要大量营养,但却将其用于合成生物质,这就是主要区别。许多类型的癌细胞的未转化部分与其相应的转化部分之间存在选择性差异。还有许多其他差异,尤其是代谢途径方面。这实际上是肿瘤细胞的发展路径,但这仅限于最开始,也就是说代谢变化与转化是相互联系的,这种联系本身就是转化过程的一部分。

这是因为肿瘤细胞在开始增殖之前,必须重新组织代谢,这里我们以一种类似肿瘤基因的蛋白 HIF1 为例。HIF1 通常在缺氧条件下被诱导表达,但许多肿瘤细胞会过度表达 HIF1。HIF1 也可在肿瘤基因途径的下游被激活,例如 RAS 或 PI3 激酶途径、AKT 途径,或 mTOR。HIF1 被激活之后通过调控糖酵解途径中的几乎所有蛋白来重组代谢,包括丙酮酸盐向乳酸盐的转化。这就是癌细胞的厌氧糖酵解。另一方面,HIF1 还能调控能够调节三羧酸循环中吸收和利用丙酮酸的蛋白,从而阻止线粒体通过呼吸作用利用丙酮酸。因此仅仅 HIF1 的过度表达就能够调控许多肿瘤基因的下游的细胞代谢。

下面我们以 mTOR 复合体对代谢的调控为例来说明在许多肿瘤细胞中,蛋白或复合体是如何改变的。同样地,mTORC1 也是在许多肿瘤基因途径的下游被激活,这些途径包括生长因子受体途径、RAS、PI3 激酶、AKT 途径等,上述途径都能导致 mTOR 被过度激活,而这种激活在大部分癌症中都会发生。mTOR 主要是增强蛋白合成,但同时也会导致许多代谢途径被激活。mTOR 能够促进脂质合成及核苷酸合成,还能够促进糖酵解途径。同样地,只有在肿瘤基因将细胞转化为肿瘤细胞时才能够重组细胞的代谢途径。由于代谢重组,肿瘤细胞更加依赖于营养物质,例如因缺乏 TSP 蛋白而过度表达 m4c1 的细胞。它们对基质中葡萄糖的缺乏更加敏感,而我们正是要利用它们的这一特点通过锁定靶标代谢来锁定肿瘤细胞。

我不会对每种代谢途径都作介绍,但通过这张非常全面的综述性图片,您可以了解有多少不同的代谢靶标,我们正在考虑将其作为选择性杀灭或尽可能地选择性杀灭肿瘤细胞的靶标 — 这里的“我们”是指学术界和企业界。我们正在考虑通过阻断葡萄糖转运蛋白来抑制葡萄糖转运。有若干个这样的例子,己糖激酶就是我上面提到过的 2-脱氧葡萄糖的靶标分子之一。其他转运蛋白对于维持会产生大量乳酸盐的细胞的 pH 也非常重要。乳酸盐的排出也同样重要,因为如果乳酸过度积累并导致 pH 下降,细胞将会死亡。还有许多人在研究谷氨酰胺的吸收和代谢,希望能够找到靶向某些类型肿瘤的关键谷氨酰胺代谢的方法。别忘了我们还有临床上已经使用了几十年的抗代谢药物。这类药物,比如众所周知的抗代谢药物甲氨蝶呤,能够阻断核苷酸合成。当然,这些药物确实能够抑制某些目标代谢途径,因此已投入临床使用,这类药物已投入使用数十年,部分药物仍在临床上使用,它们不是我们需要从头开始试验和锁定的目标代谢。对于许多非常依赖自身合成脂肪酸进而合成脂质的肿瘤细胞,脂肪酸也是一个可能的目标。

下面我将介绍有关细胞营养缺乏的一些研究,其中营养缺乏可以是完全的营养缺乏,也可以是特定营养物质的缺失,甚至也可以是正常细胞死亡,乃至我们抑制目标代谢时可能出现的细胞死亡。我们的思路是利用肿瘤的代谢锁定肿瘤细胞,但通过产生细胞毒性而不是产生白细胞郁滞的方法来杀死肿瘤细胞。

通过靶向代谢来杀死肿瘤细胞,如何使细胞死亡,这是实验中我们感兴趣的部分。因此如前所述,如果细胞的 mTOR 等途径能够被过度激活,那么它们对低营养物质水平诱导的细胞死亡将更加敏感,并且这种情况在许多肿瘤基因中都会出现。处于低水平营养物质环境下的细胞会发生什么?例如,在低氨基酸或葡萄糖含量的条件下培养细胞。首先,细胞将通过一系列的反应感知到营养物质的缺乏和能源缺乏的刺激,这些刺激将通过 AMPK 代谢检查点来激活该细胞,使 mTOR 失活并激活 p53。该检查点的作用是在低营养物质水平条件下维持细胞存活。例如,这种情况将诱发自噬,脂肪酸氧化是产生 ATP 的另一种途径。还会激活未折叠蛋白响应和损害 ER,也就是内质网。一般来说,所有合成代谢都会减弱,但如果某部分出错,细胞被迫增殖,例如由于肿瘤基因被激活而导致细胞过度增殖,细胞将会死亡。这种形式的细胞死亡会以各种不同的形式发生,研究表明这是一种半胱天冬酶 8 依赖型的细胞死亡,这是来自我们实验室的研究成果。造血细胞在缺乏营养的环境下通常经由线粒体途径死亡,其中研究较多的营养物质是葡萄糖。造血细胞,血液肿瘤细胞的死亡机制通常是激活不同的 BH3-only 蛋白,具体取决于细胞类型,然后激活线粒体途径。我们还知道某些细胞的死亡原因是坏死,这是凋亡与坏死形态的超简化示意图。坏死可能是由活性氧诱导的,目前原因尚不明确。

正如前面所述,葡萄糖剥夺可通过调控多种 Bcl-2 家族蛋白来改变线粒体途径。这张幻灯片总结了全球许多研究者和实验室的研究工作,表明葡萄糖缺乏或抗糖酵解能够下调 Mcl-1 的表达并激活 Puma、Bim、Noxa 或 Bad,从而杀灭肿瘤细胞。当基质中没有葡萄糖时,上述蛋白将被激活,使细胞通过线粒体途径死亡。有多种信号能够激活上述 Bcl-2 家族的蛋白,使细胞通过线粒体途径死亡。

实际上,我们发现使用常用的 2-脱氧葡萄糖和抗糖酵解代谢药物处理细胞时,细胞也会通过传统的线粒体途径死亡。细胞死亡并且染色质浓缩,这是 Bax 和 Bak 被激活而导致细胞凋亡的典型标志。抗凋亡 Bcl-2 家族蛋白,如 Mcl-1 或 Bcl-xL 的过度表达能够保护细胞免于死亡。使用 2-脱氧葡萄糖处理时,这些细胞死于半胱天冬酶诱导的细胞凋亡,这些是横纹肌肉瘤细胞;横纹肌肉瘤是一种儿童多发肿瘤。我们可以确定细胞死亡是由这种类型的凋亡引起的,原因是 Q-VD 等半胱天冬酶抑制剂能阻止细胞死亡。

然而,我们还发现,对于相同的横纹肌肉瘤细胞系以及不仅限于该细胞系的其他细胞系,尽管它们经 2-脱氧葡萄糖处理之后会死于凋亡,但在这里您可以看到,在经 2-脱氧葡萄糖处理的情况下,Bcl-xL 的过度表达能够阻止细胞死亡。但相同的细胞在缺少葡萄糖的条件下将以不同的方式死亡。我们知道这是因为在这种情况下,Bcl-xL 的过度表达无法阻止细胞死亡,也就是说,对于相同的细胞,由葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡中不涉及 2-脱氧葡萄糖诱导的线粒体依赖型死亡中所涉及的线粒体途径。

这是两种不同类型的横纹肌肉瘤细胞,在这里您可以看到葡萄糖剥夺是以非半胱天冬酶依赖的方式杀死这些细胞的,原因是我们使用了半胱天冬酶抑制剂 Q-VD,这种抑制剂类似 Z-VAD,但特异性更强。该抑制剂不能阻止细胞死亡,但能阻止细胞死于 2-脱氧葡萄糖诱导的细胞死亡。虽然这些细胞系在葡萄糖剥夺的情况下都死于相同的,或者说在某种程度上大体相同的坏死途径,但它们在经 2-脱氧葡萄糖处理的条件下都死于凋亡。

在相同的细胞中,葡萄糖剥夺和 2-脱氧葡萄糖会以不同的方式杀死细胞,因此我们在使用 2-脱氧葡萄糖模拟葡萄剥夺环境时需要特别注意,因为使用 2-脱氧葡萄糖模拟的葡萄糖剥夺环境与真正的葡萄糖剥夺环境实际上是两种不同的刺激机制。尽管葡萄糖剥夺和 2-脱氧葡萄糖确实都以相同的方式调控 Bcl-2 家族蛋白并下调 Mcl-1 的表达,以及随时间诱导 Noxa 的表达。实际上我们发现,细胞在经过 2-脱氧葡萄糖处理后,Noxa 起到了杀死细胞或至少部分杀死细胞的作用。所以,当我们下调 Noxa 的表达,而不下调 Bim 的表达时,会发现细胞死亡被部分阻止了。但这是使用 2-脱氧葡萄糖处理细胞时的情况,如果是对相同的 Bh4 细胞系,细胞经 siRNA 处理并下调 Noxa 的表达之后,则细胞在葡萄糖剥夺条件下的死亡方式没有变化。所以 2-脱氧葡萄糖是通过线粒体途径杀死细胞的,而对于相同的细胞,葡萄糖剥夺则是通过坏死来使细胞死亡的。这是另一类不具有 Bax 和 Bak 的细胞,因此在本示例中属于缺陷型 MEF。如果 MEF 是 Bax 和 Bak 缺陷型的,那么它们将无法进行传统的线粒体途径凋亡,原因是它们无法打开释放细胞色素 c 的通道。但我们发现,对于 Bax 和 Bak 缺陷型细胞,葡萄糖剥夺仍能将其杀死。许多实验均表明实际上这些细胞是死于凋亡。

这非常令人吃惊,细胞在没有 Bax 或 Bak 的条件下是如何死于葡萄糖剥夺诱导的凋亡的呢?这可能是因为葡萄糖剥夺激活了线粒体途径。我们发现,在本示例中,是半胱天冬酶 8 启动了半胱天冬酶活化,当我们对半胱天冬酶 8 使用大量 siRNA 或者通过单个克隆抑制半胱天冬酶 8 时,细胞可免于凋亡,不会发生半胱天冬酶 3 激活和许多其他的凋亡事件。我们仍在研究这个课题,并尝试找出半胱天冬酶 8 是如何响应于葡萄糖剥夺而被激活的。

那么细胞死亡的上游是什么?半胱天冬酶 8 激活的上游或者线粒体途径的上游是什么?我们知道葡萄糖剥夺会引发各种效应,包括 ATP 损失、干扰脂肪合成以及干扰许多依赖磷酸途径的代谢途径。但我们发现死于葡萄糖剥夺或 2-脱氧葡萄糖处理的细胞都有一个共同特点,那就是它们都会发生能够激活未折叠蛋白响应的内质网应激。这是营养缺乏时的一个常见问题,即内质网出现某些问题,例如由于氨基酸不足而无法以正常速度合成蛋白质。又或者蛋白质无法糖基化,总之上述情况会激活一系列中心或内质网,最终对代谢基因和伴侣蛋白进行调控,以试图改善或恢复内质网的内环境稳定。有研究表明,上述途径中的 PERK,ATF-4 途径能够诱导细胞死亡。我们想知道的是该途径是否也会在不存在葡萄糖或经 2-脱氧葡萄糖处理的条件下被激活,以及该途径是否以某种方式与细胞死亡有关联。

事实上,我们观察到,在 2-脱氧葡萄糖处理和无葡萄糖条件下,ATF-4 途径以不同程度被激活。ATF-4 的下游靶标 Chop 也被诱导合成,有研究表明这些蛋白能够在许多系统中导致细胞死亡。在我们的实验中,我们想办法阻止了在无葡萄糖或经 2-脱氧葡萄糖处理的条件下,ATF-4 在细胞中的积累。我们发现,在上述两种条件下,ATF-4 都与细胞死亡有关,这意味着尽管葡萄糖剥夺和 2-脱氧葡萄糖以不同方式杀死细胞,但在这两种情况下,细胞死亡都是由 ATF-4 调控的,而这一切实际上是细胞内质网应激的结果,并不是 ATP 不足的问题或是其他代谢途径的问题。需要提醒大家的是,这里所说的结论只针对横纹肌肉瘤细胞,其他类型的细胞可能以其他方式死亡。但就我们进行过细胞死亡实验的所有细胞而言,葡萄糖剥夺都是通过激活 ER 应激和 ATF-4 途径来杀死细胞的。而对于 2-脱氧葡萄糖处理的条件,有其他研究团队也得到了相同的结论。

下面我将用几分钟时间介绍一下我们的另一项研究内容 — 脑细胞局部缺血性死亡。我们希望通过抑制代谢杀灭肿瘤细胞,但不希望其他细胞由于代谢受到抑制而被杀死。但是,另一方面,还有很多疾病的诱发原因正是太多的细胞死亡,引起这类细胞死亡的原因是在某些缺氧或非缺氧条件下造成的细胞营养缺乏。总之,存在血液运输和动脉阻塞问题时,会由于没有足够的营养物质和氧气到达细胞而引发缺血现象。这是全球患者所面临的主要问题之一。当然,心肌梗塞、肾缺血是其引发的主要问题。目前我们尚未彻底掌握细胞缺血性死亡的机制,但很多研究人员都在努力研究缺氧和缺乏营养条件下的细胞死亡机制。

我们想要弄清楚的是中风时神经细胞的死亡机制。动脉阻塞会导致脑内出现局部缺血区域。脑内的部分细胞受到局部缺血的影响之后将无法恢复。动脉阻塞还会导致部分结构性损害,同样无法恢复。但也存在半影区,该区域内细胞的营养物质和氧气供给损失不那么严重。在这种情况下,细胞还有治愈的机会,原因是细胞能够在恢复营养和氧气供给的条件下自行恢复。我们希望找到能够定位半影区的方法,这样就能尽量阻止半影区的细胞死亡,并且缩小该区域,治疗该区域的损伤,但首先我们需要了解其中的细胞死亡机制。

为此,我们与爱尔兰都柏林 Prehn 教授的实验室开展了合作研究,我们在氧糖剥夺的条件下将原代神经细胞培养 45 分钟,“氧糖剥夺”这条行内常用的术语有点容易混淆,它是指培养体系中的所有细胞都处于完全的营养匮乏和缺氧的状态。这样的培养条件诱导了 Noxa 蛋白的表达。Noxa 是我之前提到过的一种 BH3-only 蛋白,培养条件恢复之后,也就是再灌注时,这种蛋白的表达会在蛋白质和信使水平迅速被诱导。我们将细胞在该条件下处理 45 分钟,然后模拟损伤消失后体内可能出现的再灌注过程,结果表明,这导致了 Noxa 增加。但在 Prehn 博士的实验室中,他们将 Noxa 缺陷型小鼠作为实验对象,发现其在细胞死亡方式上没有任何区别。无论是来自基因敲除的缺陷型小鼠还是野生型小鼠的神经细胞,细胞死亡的方式都是相同的。

对于该结果我们有些失望,但我们发现局部缺血发生后细胞诱导产生了另一种 Bcl-2 家族蛋白 — Bmf。体外局部缺血会诱导产生这种蛋白,在接受局部缺血实验处理的小鼠体内也同样存在。有资料显示,影响蛋白质合成的条件会诱导 Bmf 蛋白的产生。

本示例中,Bmf 蛋白的存在与否确实会影响细胞的死亡,也就是说进行了基因敲除的 Bmf 缺陷型小鼠可免于中风。这是一种较为温和的保护,但也是可能具有调控缺血性细胞死亡机制的功能的蛋白质之一。不仅分离的细胞得到了保护免于死亡,而且在体内局部缺血实验之后,我们通过检测多项神经功能缺损指标发现,小鼠体内的细胞也得到了保护。

最后我要感谢我的实验室里以前和现在的全体研究人员,感谢他们一直以来为今天我所演讲的研究成果所付出的不懈努力。我还要感谢其他实验室的研究人员,从他们身上我学到了很多东西,为我的研究提供了很大帮助,还要感谢与我们合作的多个不同研究机构的研究人员,当然,也非常感谢我们的赞助机构。

我将在 5 - 10 分钟后回来解答大家的问题,下面我将时间交给 Miriam,她将为大家介绍一些优秀的产品。MF:感谢 Cristina 为我们带来这次有趣并且内容全面的演讲。提示大家,您可以通过屏幕右侧的 Q&A 版块向 Cristina 提交您的问题。大家好,接下来我将利用此次机会为大家介绍一些您可能会感兴趣的 Abcam 产品和资源。

首先我们诚邀您参加九月将在英国剑桥举办的“肿瘤与代谢会议”。此次会议的内容涉及肿瘤代谢转化的重点领域,并且将着重探讨针对肿瘤特定代谢途径的潜在治疗方法。届时将会有众多杰出主讲人参加,如 Karen Vousden、Lewis Cantley 及 Pere Puigserver,并且 Cristina 本人也将出席。

如果您喜欢本次网络研讨会并且希望了解更多有关细胞凋亡的内容,您可以通过我们的网站 abcam.cn/webinars 观看之前的网络研讨会,主题包括半胱天冬酶死亡或坏死性死亡等。上述网络研讨会均可免费观看,并且您可根据需要在闲暇时观看,abcam.cn/events 页面中还列有完整的网络研讨会以及活动的预告。

我们希望让您了解到 Abcam 能够提供用于各种细胞凋亡检测和定量分析的试剂盒产品,并且这些产品适用于各种样品和分析平台。我们的产品几乎能够在细胞凋亡激活级联的任意阶段对细胞凋亡进行检测,包括半胱天冬酶激活或线粒体膜电位下降。如需了解有关这些产品的更多信息,请访问 abcam.cn/apoptosiskit。正如网络研讨会中所述,肿瘤的发生常常会导致糖酵解活性本身发生改变。就像 Cristina 所说的那样,乳酸盐的产生会使细胞环境酸化,而我们可利用这种酸化来定量细胞的糖酵解通量。我们的糖酵解分析测定产品能够通过简单的 96 孔板荧光酶标仪方法测量糖酵解活性,代替过去常用的非常繁琐的 pH 电位法。

耗氧率同样也是测定线粒体活性和细胞呼吸作用的常用参数。我们的胞内、胞外耗氧测定产品采用简单的 96 孔荧光酶标仪法,能够定量各种样品的耗氧率,如细胞样品或分离得到的线粒体样品。该检测产品还可配合 GCA1 等放射性线粒体染料使用,同时检测线粒体呼吸及线粒体膜电位的变化。

另外我们还有能够测定使用糖酵解抑制剂 2-DG处理的细胞内葡萄糖摄取量的产品,对于糖酵解抑制剂 2-DG的内容Cristina在他的报告中已经提到过。以上都是非放射性试剂盒,使用的是简单的 96 孔板方案,可配合比色或荧光酶标仪使用。该检测产品所能检测的葡萄糖及其类似物 2-DG 摄取量的最低值都是 50 皮摩尔。

我想提醒大家,在 Abacm 的肿瘤资源页面 abcam.cn/cancer 中汇集了网站中与肿瘤研究相关的所有信息。您可以找到具体产品、方案技巧、代谢途径的下载链接,以及与肿研究瘤相关的最新活动。

非常感谢。我要介绍的内容就是这些,下面我将话筒交还给 Cristina,她将回答大家的问题。

CM:非常感谢 Miriam,刚才的介绍很精彩。我们收到了很多问题,我希望能够尽量全部解答。下面我将开始解答问题。有人问到,在演讲中我展示了葡萄糖剥夺或经 2-脱氧葡萄糖处理条件下的细胞死亡数据,幻灯片中只展示了 PA 染色结果,据此是如何判断出两种条件下的细胞死亡机制有所不同的?我只展示了 PA 染色的数据,但实际上还有更多的实验数据。但我展示了可调控细胞死亡的蛋白的相关数据,例如 Bcl-xL,该蛋白能够调控 2-脱氧葡萄糖诱导的细胞死亡,而无法调控葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡。又例如,半胱天冬酶参与了 2-脱氧葡萄糖诱导的细胞死亡,而与葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡无关。我仅展示了 PI 数据,但在我展示的一个示例中,添加半胱天冬酶成功阻止了细胞死亡,但在另一个示例中却没有,这样我们就可以判定细胞死亡的类型存在差异。当然我们还需要检查许多形态学标志物,而且我们也确实这样做了,但这些标记通常是半胱天冬酶被激活的结果。所以如果半胱天冬酶未被激活或者没有参与细胞死亡过程,那么我们就可以确定这不属于凋亡。感谢提问。

另一个问题是关于细胞死亡的应激调控。目前是否有关于 Noxa 或 BMF 的 ATF-4 调控的一些已知信息?据我所知,目前尚且没有关于 BMF 的信息,但是有研究表明 ATF-4 是 Noxa 蛋白的转录因子,这一点有力印证了我们的数据。不过,我们敲除了 ATF-4 基因,然后观察了经 2-脱氧葡萄糖处理的细胞中 Noxa 的含量。但我们并未发现 ATF-4 是 Noxa 水平的调控因子。因此 ATF-4 有可能参与了 Noxa 的激活,但并不能调控 Noxa。但确实,ATF-4 是 Noxa 和 Bim 的已知调控因子。

还有听众询问 BMF 的一般功能。BMF 并不是 Bcl-2 家族蛋白中最为人熟知的蛋白,但却有大量关于这种蛋白的研究资料,尤其是 Andreas Strasser 和 Andreas Villunger 的研究。例如,BMF 能够参与影响翻译过程的环境诱导的细胞死亡,而局部缺血一定会影响翻译过程。因此 BMF 参与的是缺氧诱导的细胞死亡,同时也参与脱离诱导的细胞死亡,即失巢凋亡,也就是在细胞无法附着到基质上时发生的细胞死亡,这对病灶转移至关重要。BMF 也参与这种情况下的细胞死亡,我相信很快我们就将掌握更多有关的 BMF 功能的信息。

另一位听众想知道当我们谈到抑制肿瘤细胞的代谢时,如何区分肿瘤细胞和正常增殖细胞的,比如干细胞?尽管不属于上述问题所问的内容,但我在这里要特别提到造血细胞,比如活跃的或增殖的 T 细胞和 B 细胞。因为这些细胞的代谢也是相互联系的,确实提出这种问题合情合理,但目前为止我们还没有彻底解决这一问题。其他类型的化疗会影响其他增殖细胞,例如生发细胞,针对肿瘤代谢的治疗方法是否会有同样的问题?目前我们对此尚不清楚。化疗能够起作用是因为肿瘤细胞非常依赖其靶标的代谢过程,但仍会有一些代谢途径...这实际上与下一个问题有关,那就是相较于肿瘤细胞,正常细胞是否会进行相同的代谢过程?下面的回答对这两个问题都适用。

实际上一些肿瘤细胞的代谢酶存在特异性突变,我之前没有提及这方面内容,但这方面的研究已经开展得很广泛了。例如有人在研究异柠檬酸脱氢酶 (IDH),这种蛋白质在一些肿瘤细胞中会选择性地发生突变。这使得那些发生突变细胞得以构建不同的代谢途径,所以代谢差异确实存在,并且有研究表明许多肿瘤细胞中都存在缺陷,例如 Eyal Gottlieb 的实验室就发现了有延胡索酸盐缺陷的肿瘤细胞,至于所涉及的线粒体代谢酶的具体名称我记不清了,这种酶的缺陷导致了呼吸作用缺陷和线粒体的三羧酸循环中的缺陷,尤其是对于某些肾脏肿瘤,但这些是特定的肿瘤中发生的特定代谢途径改变,并不是所有肿瘤细胞都会发生代谢途径改变。我们不能说肿瘤细胞和非肿瘤细胞各自具有其特定的代谢途径。但确实有些特定代谢途径只存在于某些肿瘤细胞中,而我们可以肯定的是,增殖细胞具有与非增殖细胞不同的代谢途径。

下面是另一个问题,如何抑制肿瘤细胞的糖酵解?我所介绍的 2-脱氧葡萄糖就是能够抑制肿瘤细胞糖酵解的众多分子中的一种。2-脱氧葡萄糖实际上已经开始在临床试验中使用,而它仅仅是众多糖酵解抑制剂中的一种,据我所知许多公司都在开发自己的糖酵解抑制剂,这是因为肿瘤细胞比正常细胞更加依赖于糖酵解。

还有一个问题是:是否有已知的机制能够解释 2-脱氧葡萄糖与葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡响应之间的区别?这正是我们的研究内容之一。目前尚没有已知机制能够解释这一现象,但我们一直在研究 2-脱氧葡萄糖与葡萄糖剥夺诱导的细胞凋亡之间的区别,如果二者都能够诱导内质网应激,那么为什么一种诱导的是细胞凋亡,而另一种诱导的却是细胞坏死?

我们仍在努力解决该问题,目前我们不清楚 2-脱氧葡萄糖是否是因为能够提供细胞凋亡所需的某种物质才诱导了凋亡。当然也可能是其他原因,比如葡萄糖剥夺诱导细胞产生了可阻止细胞凋亡发生的某种物质。这之间有细微的差异,但我们仍不确定原因到底是什么。

还有一个问题是:谷氨酰胺剥夺会激活相同的细胞死亡机制吗?关于这个问题的研究并不多,但从仅有的一些文献报告来看,谷氨酰胺剥夺确实能够通过线粒体途径诱导细胞凋亡。事实上,有研究表明 ATF-4 参与了某些谷氨酰胺剥夺条件下的细胞死亡,所以我认为 ATF-4 途径和 ER 应激途径在由选择性的营养物质剥夺诱导的细胞死亡、由阻断特定营养物质诱导的细胞死亡,或者通过药物抑制不同的代谢途径诱导的细胞死亡中可能发挥着重要作用。

还有一个问题是:我们是否能够通过细胞形态来判断经辐射后膨大的细胞的死亡途径是坏死?不可以,这没有那么简单,您可以回顾 Abcam 的其他网络研讨会,它们更加详细地介绍了细胞凋亡。但对于这个问题,答案是不能,这不是那么简单的。凋亡过程中细胞一定会收缩,细胞核会经历非常特殊的变化,但我们还必须通过多种其他标志物来区分凋亡与坏死。我向您推荐几篇文献综述,比如其中有一篇是不久前 Oscar Tirado 和我共同发表的,其中就提到了要判断细胞死亡途径是凋亡、坏死还是其他方式需要做的实验,尤其适合肿瘤研究人员阅读。但也不是这么简单,尤其是经过辐射的细胞,这种细胞很大,如果细胞较大,那么其死亡方式很有可能不是凋亡,因为凋亡细胞通常会收缩。

非常感谢大家热情地提出了这么多问题,能够尝试着解答这些问题让我感到非常开心。这里有一个问题是:如果我们彻底阻断肿瘤细胞新的脂肪酸合成途径,能否杀灭肿瘤细胞?我只能说目前我也不清楚。有可能某些脂肪酸合成抑制剂确实能够杀灭某些肿瘤细胞,但这在很大程度上还是要取决于肿瘤的类型。并不是所有肿瘤细胞都对新的脂肪酸合成途径有依赖性;但脂肪酸合成以及能够抑制代谢途径中其他步骤的药物在将来确实有可能被用于杀灭肿瘤细胞,但这还是要针对特定类型的肿瘤。

现在我回答今天的最后一个问题,后面问题我将通过邮件回答。这个问题是:在您的实验中,您是否观察了葡萄糖剥夺之后以及经 2-脱氧葡萄糖处理之后己糖激酶在细胞中的分布?尤其是是否观察了有没有己糖激酶从线粒体被运输到细胞质或细胞核中?

没有,我们没有做这部分工作,但这是一个非常吸引人的研究方向,这也许能够解决为什么己糖激酶在不同的位置具有不同功能的问题。有研究表明,己糖激酶与线粒体结合时能够保护细胞免于发生凋亡;而关于己糖激酶被转移到细胞核,我甚至都没有想到过这种可能性。所以非常感谢您的提问和建议。谢谢,Vicky。

非常感谢 Cristina 和 Miriam 今天的演讲。如果您对此次网络研讨会上讨论的内容有任何疑问或者有任何技术问题,我们的技术支持团队将非常乐于为您提供帮助,您可以通过 cn.technical@abcam.com 联系他们。我们希望此次网络研讨会能够为您的研究工作提供一定的信息和帮助,同时我们期待并欢迎您参与今后的其他网络研讨会。再次感谢您的参与,祝您研究顺利!

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