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ELISA

细胞内ELISA简介网络研讨会

我们的细胞内 ELISA 专家会向大家介绍这个令人兴奋的应用,并且会介绍一些有用的实验优化方法和疑难解答技巧。   

细胞内 ELISA 是一种使用比色或荧光读数对培养细胞进行定量的广为接受的免疫细胞化学测定方法。在本次网络研讨会中,我们会概述细胞内检测技术的优势、关键试剂以及技术优化方法。

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网络研讨会主题:

  • 介绍 — 为什么使用 ICE 检测

  • 细胞内检测技术的优势​

  • 关键试剂​

  • 实验优化及疑难解答


主讲人简介:

John Constable 目前是我们技术支持团队的一员。他先在英国利物浦大学获得生理学博士学位,然后在美国俄勒冈大学进行了六年的博士后研修。他重点研究的是神经元突触的发育和功能。

John 研究生阶段主要研究胞吐作用,博士后阶段研究的是突触发育过程。研究过程中,John 广泛采用蛋白质印迹法、免疫荧光法和以 ELISA 为基础的应用方法等多种方法。

“一次有关技术细节的出色演示”

—与会者


In-Cell ELISA 介绍

大家好,欢迎大家参加我们今天的在线讲座,In Cell ELISA 介绍:原理和疑难解答。我很荣幸介绍今天的主讲人 John Constable。John 先在英国利物浦大学获得生理学博士学位,然后在美国俄勒冈大学进行了六年的博士后研修。他重点研究的是神经元突触的发育和功能。研究生阶段主要研究胞吐作用,博士后阶段研究的是突触发育过程。研究过程中,John 广泛采用蛋白质印迹法、免疫荧光法和以 ELISA 为基础的应用等多种方法。

欢迎大家参加今天的讲座。今天,在这次介绍 In Cell ELISA 的讲座中,我希望大家能够对 In Cell ELISA 是什么,为什么要用它以及怎样进行操作有个初步了解。

我会先从以下方面来介绍,首先,In Cell ELISA 是什么?为什么要用它?跟领域内其他技术相比,这种技术有什么优势?接着,我会带大家看一份经典的 ICE 方案,接下来,我们将讨论一些重要的注意事项,无论是使用我们的检测试剂盒还是制备自己的实验体系,大家都需要注意这些问题。最后,我会分享关于这类检测,技术支持遇到的常见问题,还有一些对检测有帮助的提示。在讲座的结尾,我会介绍一些资源,可能会对大家有用。

那么,开门见山,我首先要谈的就是什么是 In Cell ELISA。在今天的讲座中,我可能会说 In Cell ELISA,也会说成 大写的 ICE 或 小写的 ice,其实都是同一种技术。

大家在看文献或其他资料时,可能会发现这门技术在业内还有其他几种叫法,包括 In Cell Western、基于细胞的 ELISA 和定量免疫细胞化学法。

这些都是指同一种方法,也就是测定蛋白水平的定量免疫细胞化学法。或者说,如 果您对磷酸化、甲基化、乙酰化等翻译后修饰感兴趣,也可以用这门技术进行检测。在今天的讲座中,我们讨论的方案将基于怎样用这种方法来检测培养的贴壁细胞蛋白水平。也可以用这种方法来检测悬浮细胞中的蛋白水平,这在讲座的后面部分会谈到,但我们今天讨论的方案是专门针对贴壁细胞的。

以上就是关于 In Cell ELISA 的简单介绍。接下来,我们来谈谈为什么要用这一技术。当然,最大的理由就是快速简单。整个检测过程始终是在同一微孔中进行,也就是铺板、处理细胞以及检测都是在同一微孔中,试剂无需转移至试管或其他类似的容器中,全过程仅需一块微孔板。

这个方法很准确,In Cell ELISA 试剂盒可在目标时间点将细胞固定在孔中。这就是说,如果要研究随着时间的推移,药物对细胞的疗效,并且想在 0、10、20、30 和 40 分钟时间点固定这些细胞,那么,通过这一方法,可及时获得某个时间点处细胞内发生的目标蛋白或其他蛋白质变化情况。

此法非常专一,我们供应的所有试剂盒和本法采用的抗体都经过高度验证,这些抗体仅识别目标蛋白,不会发生其他交叉反应。所以用户可以对获得的结果信心十足。

这是一种定量法,可以用来生成/重现数据,产生的数据,可以参照蛋白总量或者细胞数进行定量分析。如此,就可以在孔与孔之间平行比较结果,及时获得在特定时间点下,准确反映细胞内实际发生的变化。

这是一种高通量检测。传统方法中,我们都是使用 96 孔板进行检测,现在,我们可以使用 384 孔板。所以,无论何时,我们都可以处理大量样品。也可以同时设置很多复孔,根据试剂的多少,可以做两个或三个重复。通过大批量和复孔操作,可提高得到结果的准确度,因为如果二个复孔或三个复孔都得到基本一致的结果,那么对于该结果,你可以非常自信。

在读取信号方面,本检测十分灵活,根据实验室现有的设备和试剂,可以使用红外荧光染料或比色检测,比如辣根过氧化物酶或 AP,也就是碱性磷酸酶来读取数据,因此,根据实验室的条件,本检测可满足任意这两种需求。

最后,使用这一技术,即可以进行单一抗体染色,也可以进行双重抗体染色。我们来举个例子说明为什么要进行双重抗体染色。假设您正在研究与蛋白总量相关的某一蛋白的磷酸化染色,那么可以通过这类检测研究蛋白总量与磷酸化水平的变化,也就是说您可以使用这种检测方法来解决这类问题。

以上就是 In Cell ELISA 这种技术的优势介绍。接下来,我们要将该技术与业内常用的其他技术,即蛋白质印迹法做对比。本质上,这两种技术的前面步骤都是一样的,无论使用何种规格的微孔板,都需要进行细胞涂板、转染或用目标试剂进行处理,接下来的步骤就有所不同。就蛋白质印迹法而言,处理或转染后,先要将细胞裂解,然后收集裂解物。根据是否需要检测某一特定组分,可能需要进行几次离心分离。然后,需要对目标样品中的总蛋白水平进行定量,再将这些样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳,根据所使用的膜,再转膜至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。接下来,分别用一抗和二抗孵育。最后,根据实验室现有条件,使用一种检测方法对该信号进行定量(检测)。

而就 In Cell ELISA 法而言,处理或转染细胞后,可立即将细胞固定在涂板所用的同一微孔中。接着分别用一抗和二抗孵育,再定量该信号。我们可以看到,整个过程仅有三到四个步骤。现在,我们来比较一下这两种方法所需的时间,这里所讲的仅代表一般情况,具体检测时间与样品量多少有关。

一般来说,蛋白质印迹分析的过程中,细胞裂解需要 30 分钟左右。收集细胞裂解物大约需要 15 分钟,如果有多个微孔,所需时间可能更长。此外,如果需要进行几次离心,时间就会更长。接下来是蛋白定量,大约 1 小时,同样,时间与使用的方法和实际样品数关系很大。接下来是样品的凝胶电泳,大约需要 2 小时,根据凝胶种类和凝胶电泳速度,可能快一点,也可能慢一点。接着是转膜步骤,差不多又需要 1.5 小时左右。同样,根据设置,可能快一点,也可能慢一点。一抗和二抗孵育大概 3 至 4 小时,根据一抗的效果,可能需要孵育过夜,以便获得良好的信号。接下来,根据所用方法,定量步骤可能需要 30 分钟左右。总之,如果按计划进行,从开始裂解细胞到获得数据,大约需要 8-9 小时。

而另一方面,使用 In Cell ELISA 进行检测的情况,在细胞固定这一步大约需要 30 分钟,接着进行一抗和二抗孵育。按照我们大多数方案,一抗孵育的时间可以是常温 2 小时,也可以是 4 °C 过夜。4 °C 过夜非常方便,如果您是傍晚开始实验,且晚上不想熬夜,那么只需加入一抗并放入冰箱过夜就行。也可以先一抗染色2小时,再用二抗孵育,需要 1-2 小时。最后,定量大约需要 30 分钟。我们可以看到,所有步骤可在一天之内完成,大约 4 小时左右可获得结果,非常快速。4 小时内可获得结果,也就是说 4 小时内就能获得大量信息。如果同时操作一块或两块 96 孔板,那么在短时间内就可以获得相当丰富的信息。

以上就是 In Cell ELISA 是什么、为什么要用这种方法以及与业内其他常用技术相比有何优势的相关内容。下面,我要给大家介绍典型的 ICE 方案,我们一步一步来,让大家都清楚每一步的情况。

先来看第一张幻灯片,我们这里看到的是一块 96 孔板的俯视图,大家可以直观地看到这块微孔板的样子。在右边,是其中一个微孔的侧面。

根据 ICE 方案,我们要做的第一步是,将细胞接入微孔板。此时,保证最佳接种密度非常重要,一定要让细胞在孔底形成一层均匀的单细胞层,不能到处都出现细胞团。所以在这个过程中,最佳接种密度非常重要。

接下来,我们将根据需要处理细胞,这些橙色的小点代表处理或转染。那么,如何处理细胞,这完全取决于要进行的研究。有些时候不需要进行处理,但有时候需要,这取决于实验。

第三步是向接有细胞的孔中加入固定液,通透细胞,然后用试剂盒提供的溶液或自制的封闭液封闭细胞。

接下来,加入一抗,正如我在上一张幻灯片中提到的,可以用一抗孵育 2 小时或 4 °C 过夜。事实上,在我们做过的测试中,放置过夜与室温放置 2 小时,信号没有明显差别。放置过夜非常方便,我前面说过,如果不想在实验室熬夜,且必须下班,只需放入冰箱,第二天处理就行。

接下来,添加带有标记的二抗,室温下孵育 1-2 小时。最好不要超过 2 小时,否则会出现高背景问题。这是实验过程中必须要进行的步骤。

第六步也是最后一步,即信号读取,可以使用荧光法或比色法。

大家请看这两个实验,我想说的是,使用的检测方法不同,得到的信号也会有差异。如果使用荧光法,那么根据我们大部分的荧光试剂盒,会在 IR700 或 800 波长处读数。基本上,可以在酶标仪上同时读出这两个波长处的读数。但是,通过比色反应检测的情况,如果用 AP 和 HRP 进行双重抗体染色,则必须先加入显色剂。比如,在加入了 AP(碱性磷酸酶)的微孔中加入显色剂,读出相应的波长。然后,吸出该溶液,再向添加了 HRP 的微孔中加入显色剂,读出该波长。通过比色反应检测时,若需要进行双重抗体染色,那么也会涉及到这一步,但这并不费时。

无论是用荧光法还是用比色法读取信号,这之后需要做的是,用詹纳斯绿染料进行一次全细胞均一化。这样就能对所有孔挨个进行比较,获得细胞活动的准确反映。

现在,我将简要介绍一下本技术的一些方案,并且为大家展示使用这类检测得到的一些数据。这是我们的一款 MitoBiogenesis In Cell ELISA 试剂盒,看起来有点复杂,希望通过我的讲解大家能够理解。如果注意看左边的抗体板,可以看到最顶上的板呈绿色,我们看到的是变成伪彩绿色的 COX-1 信号。接下来是变成伪彩红色的 SDH-A 板,其下方是一个通道叠加的图像。凡是 COX-1 和 SDH-A 信号都很强的地方,在这个混合图像中就呈现黄色,而在 SDH-A 信号远远超过 COX 信号的地方,可以看到更深的橙色。

本检测中,我们对两个地方进行了处理,一处是前六个微孔。微孔板的这一侧是对照组,而板的另一侧则用氯霉素处理。我们不仅比较了对照组细胞和处理组细胞,我们还比较了接种密度从每孔 100000 个细胞降到每孔 1000 个细胞的信号。这里,我们希望得到两个信息。第一点,COX-1 是线粒体编码蛋白,而 SDH-A 是核编码蛋白,我们希望通过这个检测,可以知道氯霉素处理对这些蛋白水平的影响。我想大家可以清楚地看到,在用氯霉素处理的细胞中,COX-1 信号大幅下降,SDH-A 信号则没有。这说明,氯霉素特异性地抑制 COX-1 信号,而不会抑制 SDH-A 信号。我们还可以发现,在对照组中,随着细胞浓度的降低,信号强度也在下降,这与我们预期的一致。根据本检测,我们可以得出,氯霉素特异性地抑制线粒体编码蛋白 COX-1,而不会抑制核编码蛋白 SDH-A。这是一个典型的例子,说明为什么可以用这种方法研究某一药物治疗是否会影响目标蛋白,而不是整个细胞。以上是左边这部分的内容。

我们来看下右边的图,我们采用这类检测的目的是看看有没有可能测定药物作用的 IC50 值。我们进行了同样的实验,但这里要研究的是氯霉素的不同浓度,并看看微孔中所加氯霉素的浓度升高对蛋白质相对表达水平有什么影响。大家可以清楚地看到,对 SDH-A 而言,就是图中这条黄线,随着氯霉素浓度增加,这种核编码蛋白没有受到影响。因此氯霉素不会影响细胞水平的生物学过程,这也是我们的管家基因。而这条绿线代表的是 COX-1 相对信号,随着微孔中氯霉素浓度增加,得到的 COX-1 相对信号越弱。利用这一点,我们可以得到药物作用的 IC50 值,这是本试剂盒的另一个用途。

我们来看看这项数据的重现性如何,还有准确性。右下图显示的是在不同的三天平行进行的同一检测。第一天,可以看到第一次实验的抑制率是 89%,在第二次的时候,得到的抑制率是 85%,同一天中,试剂盒得到的数据差别非常小。第二天的时候,结果呈现同样的规律,复样检测结果之间差别很小。第三天也同样如此。在平行复样方面,样品差异很小。大家所看到的就是一般情况下,本方法的准确度和重现性。由于是同一天操作两次,因此得到了非常相近的结果,但是三天重复实验表明,得到的结果非常一致。那么,这里向大家展示了这类检测的准确性以及信息量。这是本检测的一个应用案例,我们可以通过这种方法研究药物对两种蛋白水平的相对影响。

在我们技术支持过程中,有个常见问题是,细胞接种密度应该是多少?其实,这主要取决于几点。首先是使用的细胞系,再就是目标分析物和抗体的丰度,这里还需要重点考虑实验时间。

其实,这些可以都归结为一点,就是在固定细胞时,要确保得到紧密的单层细胞。

因此,实验前要考虑的因素是,实验细胞有多大?细胞越小,要接种的量越多,那么生长速率又是否满足需要;如果早上九点涂板,第二天早上九点,细胞是否会发生过度生长?实验时间多长?如果计划进行几天的实验,那么在设计接种密度时应该考虑进去。这样,到最后一天固定细胞时,可确保细胞长成紧密的单层。因此,我们建议,在开始 In Cell ELISA 前,先进行几次预实验,测试不同的细胞密度,看看它们随着时间的生长情况如何。然后根据预实验结果,得到实验需要的最佳细胞密度。

还需要记住的一点是,我们所做的任何处理都可能影响细胞的活性。这其实会造成一个问题,就是实验结束时,处理过的细胞数量与未处理的细胞数量是否一致。用詹纳斯绿染色可一定程度解决此问题,但是,如果细胞死亡率真的很高,或测定的是病态细胞,则需要重新评价这种方法是否适用。如果有许多细胞相继死亡,那么必须考虑,此时的结果实际的可靠性和重现性问题。

下一个问题是,可以用悬浮细胞吗?我开头提过,是的,我们可以使用这个方案检测悬浮细胞,这是该方案的链接。我们需要做的是,在一块普通的 96 孔板中培养和处理细胞,接着转移到一块新的胺基包被的 96 孔板中,将细胞离心到板底。加入固定液,离心,然后按标准方案继续操作。这很直观简单,这个链接会给大家提供更多详细信息。

接下来,给大家介绍几点大部分人觉得有用、且对这些实验有帮助的提示。首先是采用哪种微孔板?我们建议,用黑壁透明底的微孔板,而且是胺基包被的微孔板,以使细胞更好地贴附。

移液过程则与其他很多类型的 ELISA 检测或是别的检测,甚至是在孔里进行染色的免疫荧光检测一样。移液枪头不要碰到孔底,否则会刮去许多细胞,导致损失很多信号。这样一来,可能会得到几团细胞,虽然能产生信号,但会影响实验结果。

关于固定液,我们在研发阶段一般只用多聚甲醛,实验中也同样使用的是多聚甲醛。其他固定液应该可行,所以,如果想用甲醇或丙酮之类的固定液,应该不是问题。大家可能想更换或使用其他固定液,那么在进行 ELISA 之前,需要先找到该固定液的最佳时间,因为适合多聚甲醛的条件不一定适合甲醇或丙酮。

在对照方面,至少要用一个“非一抗”对照孔。一个孔就可以了,如果有空间,就用两个孔,但至少得有一个。

此外,我前面强调过,本检测法的其中一个优势在于,可以同时进行平行实验。所以每个条件都可做两个或三个平行,取决于检测量或有多少样品和试剂。

到目前为止,就像我一直提到的一样,我们已经介绍了什么是 In Cell ELISA、典型的 ICE 方案、对检测可能有帮助的几点提示以及常见问题,希望大家对 In Cell ELISA 有所了解。接下来,我要介绍几个资源页面,结束今天的讲座,希望对你们有用。

这些是 ICE 方案的链接,有 Abcam 网站的,也有 MitoSciences 网站上的。下面是 ICE 应用说明,或者说 ICE 应用指南。这里面包含许多有用的信息,如有可能,请大家浏览一下,会很有帮助,至少我是这么认为的。

这张幻灯片中,事实上,我在进行实验的时候,觉得这个表格真的很有用,尤其是进行不同类型的 ELISA 或类似检测的时候。一般来说,如果使用 96 孔板,并且在不同的孔中进行多个处理,有时其实很难追踪各个孔的实际情况。而我们可以将这个表格打印出来,在实验过程中对追踪每孔的操作情况很有用。不仅如此,有时我们会收集全部数据,而不会在一两天内分析,我们会发现有时很难记住具体操作。有这样一个表格,就会很有帮助。

Abcam 拥有一支非常庞大的科学支持团队,在上海,香港、英国剑桥、日本与美国各有一个办事处。如果对这个技术或相关产品感兴趣,都不妨给我们发邮件,或者根据所提供的信息致电我们。

最后,谢谢大家参加这次讲座。我希望通过这次讲座,大家对这项技术是什么、为什么要用它以及怎样操作,能够有所了解。再次感谢大家参加今天的讲座。再见。

最后,谢谢大家参加这次讲座。我希望通过这次讲座,大家对这项技术是什么、为什么要用它以及怎样操作,能够有所了解。再次感谢大家参加今天的讲座。再见。


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