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ChIP原理简介和疑难解答网络研讨会

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观看由染色质免疫共沉淀 (ChIP) 专家提供的点播网络研讨会     

ChIP 是一项非常强大的技术,可以分析基因组中 DNA 区域的蛋白质定位。利用抗体选择性地富集染色质组分可以分离 DNA 区域和相互作用的蛋白质。

识别蛋白质或蛋白质修饰的抗体可用于确定基因组中蛋白质的定位和翻译后修饰。ChIP 技术可用于任何研究领域,以进一步阐明自然状态下基因的功能和调控作用。

本次网络研讨会将概述如何优化 ChIP 实验。

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核小体是由DNA和组蛋白形成的染色质基本结构单位。每个核小体由146bp的DNA缠绕组蛋白八聚体近两圈形成。核小体由H2A、H2B、H3、H4 四种组蛋白组成,每种组蛋白各有两个拷贝。核小体在 H1 和非组蛋白介导下进一步压缩形成染色质纤维。组蛋白的 N- 和 C-端尾部从核小体的中心向外延伸,大量氨基酸残基就很容易被化学基团所修饰,如发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、瓜氨酸化修饰等过程。脯氨酸顺反异构化使得组蛋白尾部发生构象变化。这些修饰可以破坏染色质接触,或影响非组蛋白招募到染色质。已经确定大量能够催化添加或去除这些组蛋白修饰的酶。组蛋白 H3 是研究得最多的组蛋白,大多数修饰存在于末端尾部。

网络研讨会主题:

  • 染色质和 ChIP 简介
  • ChIP 实验方案
  • 抗体选择
  • 疑难解答提示和实验优化
  • ChIP 资源


主讲人简介

Karen Halls 博士于 2007 年加入 Abcam 的技术支持团队,目前担任技术支持部经理一职。她在伯明翰大学取得了生物学理学学士学位,之后在剑桥大学取得博士学位。

Karen 在研究 SET 蛋白和新型组蛋白修饰的 Tony Kouzarides 教授实验室完成博士研究,并取得博士学位。她致力于研究人类基因组测序项目,具有丰富的 ChIP 实操经验。


ChIP 原理简介和疑难解答

​大家好,欢迎各位参加 Abcam 的 ChIP 简介在线讲座。我们对这次讲座进行了录像,稍后大家可在 Abcam 博客上查看。今天的主讲人是我们的科学技术支持团队经理 Karen Halls 博士。Karen 本科就读于伯明翰大学获,博士就读于剑桥大学。她博士期间师从于Tony Kouzarides 教授,研究方向是SET蛋白和新型组蛋白的修饰。Karen 曾从事于人类基因组测序项目,具有丰富的 ChIP操作经验。她于 2007 年加入 Abcam 科学技术支持团队。今天与 Karen 一起进行讨论的还有我们新产品团队的 Miriam Ferrer。Miriam本科就读于巴塞罗那大学,博士就读于阿姆斯特丹自由大学。在博士期间,她的研究课题是利用Falconie anaemia细胞的顺铂敏感性进行癌症治疗。在博士后期间,她在剑桥的 LMB 从事于 BRCA1研究,进一步拓展了她在 DNA 修复领域的经验。Miriam 于 2008 年加入 Abcam。

和之前一样,如果您在讲座中有任何问题,您可随时通过屏幕右下方的 Q&A 面板提交问题。您提交的问题会在本次讲座最后的疑难解答环节进行答复。现在,我们有请 Karen 开始 ChIP 的在线讲座。

KH:谢谢,Lucy。欢迎大家来到我们的 ChIP 在线讲座。感谢各位今天抽出时间来参与我们的讲座,我希望你们通过本次讲座获得有用的信息。本次讲座将分为多个议题。首先,我会简单介绍染色质和ChIP 技术的背景知识。然后,我会逐步讲解实验步骤。同时我会详细介绍 ChIP 如何选择抗体。接下来,我会讨论ChIP实验如何优化以及常见问题的分析解决。最后,Miriam 将详细介绍实验方案资源。现在我开始介绍染色质和 ChIP如何应用。染色质的功能是包装 DNA,它可以在细胞内强化 DNA,协助细胞进行有丝分裂和减数分裂,帮助调控基因表达。真核生物的染色质是 DNA、RNA 以及蛋白质的复合物。蛋白质的主要成分是组蛋白,而其他诸多染色体蛋白也会起到显著作用。

核小体是由DNA和组蛋白形成的染色质基本结构单位。每个核小体由146bp的DNA缠绕组蛋白八聚体近两圈形成。核小体由H2A、H2B、H3、H4 四种组蛋白组成,每种组蛋白各有两个拷贝。核小体在 H1 和非组蛋白介导下进一步压缩形成染色质纤维。组蛋白的 N- 和 C-端尾部从核小体的中心向外延伸,大量氨基酸残基就很容易被化学基团所修饰,如发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、瓜氨酸化修饰等过程。脯氨酸顺反异构化使得组蛋白尾部发生构象变化。这些修饰可以破坏染色质接触,或影响非组蛋白招募到染色质。已经确定大量能够催化添加或去除这些组蛋白修饰的酶。组蛋白 H3 是研究得最多的组蛋白,大多数修饰存在于末端尾部。

ChIP 的原理很简单,通过对含有特异性抗原的染色质片段进行选择性浓缩,鉴定抗原结合的特异性 DNA。最常见的目的是分析修饰组蛋白或染色质结合蛋白在基因组上的存在情况。在体内使用特异性抗体来确定基因组中一个或多个位点处相应抗原的丰度。利用抗体拉出目标蛋白或修饰蛋白,确定其在基因组中的结合位点。接下来我将通过一些例子来进行阐述。通过 ChIP,我们可以比较不同位点的蛋白质或修饰蛋白质的富集程度。在这个例子中,我们分析了H3K3乙酰化组蛋白在一些已知活性及非活性位点富集程度。如条形图所示,这个H3K3乙酰化组蛋白在所分析的活性基因位点处富集。

还可利用 ChIP 分析特异位点蛋白质或修饰蛋白结合情况。这个例子中,利用 RNA 聚合酶 II 5号位丝氨酸磷酸化特异性抗体分析了γ 肌动蛋白基因位点处活性 RNA 聚合酶结合情况。RNA 聚合酶 II定位在 γ 肌动蛋白基因的 5' 端,是这个是RNA 聚合酶 II结合的特异性位点。最后,ChIP 还能够在一段时间内对基因位点处的蛋白质或修饰蛋白进行定量。这个例子中,在可诱导的 pS2 启动子上分析了瓜氨酸化的H3。用雌激素进行进一步诱导,每隔十分钟取样,每个时间点的细胞都用特异性抗体进行独立的 ChIP 实验。修饰的组蛋白在启动子上富集程度周期性变化,40 分钟时瓜氨酸化H3组蛋白富集量最高。ChIP 实验有两种常用方法:自然 ChIP 和交联 ChIP。应根据您的实验或目的、以及起始材料来进行选择。两种技术之间有些关键的区别。

在自然 ChIP 中,蛋白质没有交联,底物是天然染色质。通过微球菌核酸酶消化实现片段化,使用酶进行消化就可以得到约 150对碱基对的单个核小体片段。自然 ChIP 只适用于与染色质稳定结合的蛋白质,通常只有组蛋白和修饰过的组蛋白符合这一条件。在交联 ChIP 中,通常使用甲醛可逆交联剂使蛋白质与 DNA 交联。染色质经超声处理而片段化,产生 200 至 1,000 对碱基对的随机片段。由于蛋白质是交联的,可分析组蛋白、修饰过的组蛋白以及染色质结合因子。交联ChIP 是 Abcam 的标准化ChIP应用抗体鉴定方法。自然 ChIP和交联ChIP两种技术各有利弊。在自然 ChIP 中,由于表位不受固定的影响,抗体特异性是可预见的。因为抗体可以有效地结合到目标抗原上,可以实现有效的免疫沉淀。由于酶切消化可以使 DNA 片段化至核小体大小,约 175 碱基对,分辨率更高,目标抗原的定位也更准确。

但是,自然 ChIP 只适用于组蛋白,因为染色质结合因子没有紧密地连接到 DNA,在样品制备阶段可能会丢失。酶切消化也会引起选择性核酸酶消化,因为微球菌核酸酶会偏向于一些基因组序列,导致消化不均一。同时由于核小体没有固定,也可能发生核小体重排。最后,因为相互作用没有稳定固化,整个过程务必要小心谨慎。交联 ChIP 非常适用于那些与 DNA 结合能力较弱或者间接结合的非组蛋白,因为交联会固定这些相互作用。因为相互作用稳定了,交联可与让核小体重排降至最低,同时实验之间的差异性也会相应减少。对于酵母和其他不容易制备天然染色质的生物体,交联ChIP 也是首选。DNA 经超声处理而随机片段化。但是,抗原表位破坏可能导致的低效的抗体结合,可能需要测试多种不同抗体,找到最佳抗体。

瞬态相互作用被固定,可能导致人为结果。由于生成的染色质片段更大,靶标定位到更大的区域,交联ChIP 得到的靶标定位分辨率更低。接下来,我会讲一下实验步骤和实验细节以及实验要包含哪些对照。ChIP 的实验步骤比较简单明了。如果要进行交联ChIP,需固定细胞使 DNA 和蛋白质交联。两种技术中,都要用裂解缓冲液制备单细胞悬浮液。然后,分别通过微球菌核酸酶消化(N-ChIP)和超声处理(X-ChIP)打碎染色质。然后使用抗体对含靶标染色质片段进行免疫沉淀。随后进行 DNA 纯化和分析,确定相对 Input DNA 的目标富集区域。如果进行交联ChIP,第一步交联可以稳定蛋白质/蛋白质和蛋白质/DNA 相互作用。组蛋白本身通常不需要交联,但是如果目标蛋白没有特异性地结合到 DNA,没有交联的话 ChIP 的效率会低一些。

交联的目的是:将某个时间点 抗原与染色质结合位点相互作用固定住。甲醛可以使蛋白质/蛋白质之间形成可逆的连接,让我们可以研究组蛋白和染色质结合蛋白。如果染色质没有被固定,那么结合在上面的蛋白很有可能丢失 。关于甲醛的工作浓度,如果是细胞培养夜我们用 0.75%甲醛,如果是组织则用 1.5%甲醛。对于细胞培养夜,我们将甲醛直接加入细胞中,如果是组织, 加入到解离组织后的细胞悬液中。固定时间范围是 2-30 分钟,然后用冰置预冷的 PBS 清洗细胞,最后用裂解缓冲液悬浮细胞。下一步是将染色质片段化。这一过程染色质处于可溶状态,同时我们还能确定检测分辨率。分辨率就是指特定蛋白结合位点定位的准确程度,理想的片段大小介于 170 至 1,000 对碱基对之间。片段化之前用裂解缓冲液制备单细胞悬浮液。如果进行交联ChIP,染色质经超声处理随机片段化,最佳片段大小介于 200 至 1,000 对碱基对之间。

超声处理不宜过度,如果过度核小体会从染色质上解离。为使解离的可能性降到最低,片段大小通常会比单个核小体稍微大一些。如果进行 自然ChIP,使用微球菌核酸酶在 37 ℃ 下消化染色质五分钟,然后加入 EDTA 终止反应。离心后上清中则包含更小的单个核小体片段。用裂解缓冲液将沉淀物进重悬后通过透析分离较大的片段。自然ChIP 的优势在于我们可以分离单个核小体和寡聚核小体片段;也就是说,我们可以将修饰过的组蛋白与核小体精确的结合在一起。但操作起来有一定难度,要特别小心,核小体在酶消化过程中可能发生重排。这时候对染色质片段化条件进行优化就很有必要。下一步是进行免疫沉淀,纯化含有靶标的染色质片段。我们使用抗体来分离蛋白质和 DNA 复合物。然后利用抗体结合固相基质将整个复合物拉下来。将片段化的染色质样品与靶标的一抗一起孵育,然后在 4 ℃ 下与抗体结合基质旋转孵育过夜。抗体的使用量通常为 1 到 10 微克。

与抗体结合的基质通常是偶联有蛋白 A 或蛋白 G 的琼脂糖、琼脂糖凝胶微珠或磁珠。确切的基质选择取决于抗体的种类和亚型。第二天,对免疫共沉淀 复合物进行洗涤,排除任何非特异性结合。这里我们要设置 Input DNA,因为Input DNA代表了 免疫共沉淀中所用的染色质的量。下一步是从免疫沉淀复合物中纯化 DNA,量化靶标所结合的位置。如果样品已交联,那么就有必要对蛋白质/蛋白质和蛋白质/DNA 进行解交联处理。这个步骤同样包括 Input DNA解交联,Input DNA代表了用来与抗体孵育的样本中所含有的总染色质。我们 一般使用含有 1% SDS 和 100 mM 碳酸氢钠溶液将蛋白质/DNA 抗体复合物从微珠上洗脱下来。如果细胞已交联,那么洗脱的 复合物 会与蛋白酶 K、核糖核酸酶 A、或氯化钠在 65 ℃ 下孵育四到五小时解交联。解交联的影响因素很多。如果是自然ChIP实验,无需进行解交联,但与蛋白酶 K 孵育有时可以提高 DNA 提取量。最后用 PCR 纯化试剂盒或苯酚氯仿提取纯化 DNA。

我们通过DNA 分析来确认靶标的富集程度或结合位置。富集程度通过结合 DNA 或免疫沉淀 DNA 与 Input DNA的比值来计算。这是因为靶标的富集程度取决于多个因素,例如抗原的可及性、抗体亲和力、 免疫共沉淀 条件、起始材料或样品量。因此,在介绍的所有分析方法中,总是用特异性抗体结合的 DNA 量与 Input DNA量相比即与起始样品中 DNA 的总量相比。DNA 分析有三种关键方法:ChIP (PCR) ,ChIP芯片和 ChIP测序。现在我将详细介绍这些方法。ChIP (PCR) 中,用实时定量PCR 对分离的 DNA进行定量,通常是采用 TaqMan 或 SYBR Green 技术实现扩增,并通过测量荧光的变化来同步定量目标 DNA 分子。ChIP(PCR)可以在多个样品中分析指定区域,与 ChIP芯片或 ChIP测序相比,这种方法更快、更实惠。荧光水平与目标 DNA 量成正比可以用来检测抗体的结合,靶蛋白的存在。

这个例子里,U20S 细胞的 ChIP 中,我们使用了能够检测组蛋白 H3 9号位赖氨酸三甲基化 的特异性抗体,货号是 ab8898。 我们用活性、非活性和异染色质基因区域设计的特异性 DNA 引物,以免疫沉淀DNA 和 Input DNA作为模板进行PCR。从而得到 Input 和 ChIP 样品中目标 DNA 的实际量。该图显示了相对于 Input 的 DNA 量, 我们在异染色质基因中可以观察到更多的 DNA扩增。这说明了组蛋白 H3 9号位赖氨酸三甲基化修饰的组蛋白在这些基因中富集。ChIP芯片采用了微阵列技术,为蛋白质和修饰过的蛋白质在全基因组定位提供了高分辨率。通过将纯化 的DNA 进行荧光染料标记。然后将荧光标记 DNA 应用于到阵列,通过后续的图像分析,记录每个基因位点上目标蛋白相对于 Input 的富集程度。

在下面这个例子中,带有GFP 标签蛋白已经定位在酿酒酵母微阵列中了。我们在ChIP芯片技术中使用了货号为ab290的GFP抗体,得到的 DNA 应用于酵母微阵列。GFP 抗体的样品显示为绿色,没有标签的对照显示为紫色。阵列中两个特异性基因启动子区域的 DNA 水平明显增加,说明目标蛋白在这些区域富集。ChIP测序中,将分离的 DNA 利用二代测序技术直接进行测序,得到全基因组曲线。从而知道抗原在基因组上的分布。免疫沉淀的 DNA 比对到基因组中,几天内完成对大量 DNA 的测序。这个例子中,在 ChIP 中使用了5号位丝氨酸磷酸化RNA 聚合酶 II特异性抗体,直接对分离 DNA 进行测序。从图上可以看到在两个基因启动子处 DNA 富集水平达到峰值,说明 5号位丝氨酸磷酸化RNA 聚合酶 II 在这两个启动子处富集。这只是基因组上特定区域的截图,但利用 ChIP测序,我们可以研究基因组中的任何区域。

在ChIP 实验中为了保证实验按预期进行,我们需要设置几个对照。阴性对照可以反映实验的背景。只使用微珠或使用带有同型免疫球蛋白的微珠。例如,如果我们用的是目标蛋白兔IgG 一抗,我们就用兔IgG做阴性对照。我们ab27478兔 IgG。阳性对照就是已知蛋白或修饰过的蛋白与基因组某区域结合,阴性对照就是已知蛋白或修饰过的蛋白与基因组某区域不结合。这应当从全基因组图谱上进行审查,或者设计特异性引物并用实时 PCR 检测。这能告诉我们所观察到的富集是否具有特异性。有些抗体能产生非特异性富集,这可以通过阳性和阴性对照位点的信号来确定。PCR中始终要设置不加模板的对照,它会帮助我们排除污染的影响,因为不加模板对照中不应有扩增。最后,使用已知靶标结合位点的阳性对照抗体。利用PCR分析基因组中阳性靶标结合的区域是否富集,这样可以确保实验顺利进行。

如果研究活性区域,我们可以使用对四号位赖氨酸三甲基化H3组蛋白特异性的抗体,例如 ab8580。它在转录活跃区域富集。如果研究非活性区域,我们可以使用27号位赖氨酸三甲基化H3组蛋白抗体,例如ab6002。这两只抗体我们都可以用来做阳性对照确保实验的每一步顺利进行,如果这些修饰过的组蛋白结合区域不是您感兴趣的,那么它们就不适和,因此对照必须具有特异性。接下来我们通过四号位赖氨酸三甲基化H3组蛋白特异性的抗体ChIP结果来说明使用对照的方法。黄色的是微珠的阴性对照,它为我们提供背景水平,应该比抗体的信号要低得多。像 GAPDH、LPL30 和 ALDOA等多种活性基因区域可以作为阳性对照,因为在这些区域发现了四号位赖氨酸三甲基化H3组蛋白的结合。像MYO-D、SERPINA 和 AFM 等非活性基因区域可以作为阴性对照,因为在这些区域没有四号位赖氨酸三甲基化H3组蛋白的结合。这里虽然没有显示不加模板对照,但我们进行了 PCR,结果没有观察到扩增。我们已经知道ab8580抗体靶标在活性基因区域富集,因此,我们可以用它作为研究染色质结合蛋白或其他修饰过的组蛋白阳性对照抗体。

接下来,我将讨论如何选择合适的抗体。ChIP 中,抗体用于捕捉特异性 DNA 结合蛋白,成功与否取决于抗体的质量如何。有各种ChIP级别的抗体,接下来我会向大家介绍选择合适抗体的一些窍门。有些抗体即使它可有效应用于 IP,也可能无法有效应用于 ChIP 。这主要是受交联的影响,因为交联可以使特异性表位能产生或丢失。理想情况下,抗体应当进行亲和纯化,以避免交叉反应。修饰过的组蛋白相关抗体应通过WB测试与其他修饰的组蛋白交叉反应。在这个例子中,货号为ab8898,27号位赖氨酸三甲基化 H3组蛋白已经用一系列多肽进行了竞争实验测试,检查其是否与其他修饰的组蛋白结合。这个实验中,所测试的大多数多肽的交叉反应均处于低水平。与该抗体发生轻微的交叉反应是9号位赖氨酸三甲基化修饰多肽,这是符合预期的,因为 K9 附近的氨基酸与 K27 附近的相同。我们也可以通过 ELISA 多肽阵列检查交叉反应。

在这个例子中,我们对 ab8580 抗体进行了不同位置修饰的H3 组蛋白多肽阵列测试其交叉反应。在这个多肽阵列里有4号位,9号位或27号位赖氨酸单双三甲基化修饰组蛋白修饰多肽。我们将每种抗体稀释六个不同稀释度同时在多肽阵列上做三个平行,平均结果后绘制成图。结果显示 ab1342 与4号位赖氨酸三甲基化 H3组蛋的结合程度高,说明这种抗体特异性地识别四号位三甲基化修饰的组蛋白。免疫沉淀、免疫组织化学和免疫细胞化学是 ChIP 成功的良好指标。在这些技术中,抗体能在复杂实验环境下识别接近天然构象的抗原表位。蛋白质印迹中,抗原表位变性了,所以实验环境不同,表位存在的方式也不同。因此,如果抗体可有效应用于 IP、IHC 或 ICC,它很可能也可应用于 ChIP。

那么多克隆抗体或单克隆抗体应用于 ChIP 那种更好?这还有争议。因为各有利弊。多克隆抗体含有识别靶标的混合抗体群,所以它在 ChIP 中起作用的可能性增加了。因为如果一个抗原表位被遮挡了,抗体群中的其他抗体会识别没有被遮挡的抗原表位,并与之结合。这与单克隆抗体相反,单克隆抗体从单个克隆获得,只识别单个抗原表位。如果该表位被改变或遮挡,那么抗体就不会与之结合,抗体就不能起作用。但是,单克隆抗体表现的批次间偏差更小,因为它在各批次中识别的表位相同。而多克隆抗体群在批次之间有差别,表位识别可能改变。最后,对于一些高质量的抗体,选用单克隆还是多克隆抗体并不是选择抗体的关键决定性因素。要得到最优结果,条件优化是比不可少的一个环节,在下一节我会指出需要特别注意的部分。

甲醛用作交联剂来固定蛋白质/蛋白质和蛋白质/DNA 相互作用。如果我们发现样品固定的时间太长,我们需要要加入甘氨酸来终止交联。固定时间范围在 2-30 分钟,通常我们摸索条件时从10-15 分钟开始进行优化。组织样品可能需要的固定时间长一些,因为渗透水平要慢些。交联过度会导致抗体结合率下降,降低免疫沉淀效率,因为抗原可及性降低了。交联过度还会导致靶蛋白结合率下降。交联不充分则会导致蛋白质解离,因为 DNA 与蛋白质之间没有稳定的连接。最好以标准条件为起点,然后根据需要进行优化,在一个时间段内用不同浓度的甲醛进行优化。

优化 DNA 片段化同样也很重要,最理想的片段大小是 150 至 1,000 对碱基对。超声处理的条件受到泡沫和细胞密度的影响,因为这会影响溶液中的能量转移。交联影响溶液的密度。有些细胞类型和细胞系比其他类型更容易进行超声处理,因此,有必要针对所用的每种细胞类型优化染色质片段化,然后在重复所有结果时保持参数不变。右手边的这个例子中显示了超声处理不同的时间。U2OS 细胞经超声处理的时间各为 5、10、15 和 20 分钟后进行节交联,纯化DNA,琼脂糖凝胶电泳。随着时间的递增片段大小递减,最优片段大小出现在 15 分钟。在 20 分钟时,在超声处理过程中,DNA 可能由于超声处理过度而丢失了蛋白质;这会导致核小体从 DNA 上脱离出来。

同样,用微球菌核酸酶消化时,要优化核酸酶使用浓度和孵育时间。高浓度和长时间的消化可能会让染色质过度消化,生成亚核小体和颗粒。在使用新的酶母液和样品时,我们都需要优化,因为条件会有所不同。在使用抗体时,我们要确定每个抗体的最优使用浓度,以提高信噪比。通常在25 微克染色质我们加入1 到 10 微克抗体;我们可以从5 微克开始优化。在所示例子中,在 2 微克和 10 微克水平上测试了 货号为ab12089 的抗 TBP 抗体。TBP 定位活性基因区域;使用 2 微克时,信号和背景相似,活性基因与非活性基因区域之间几乎没有区别。但是,使用 10 微克时,信号显著增加,尤其是活性基因区域,因此在这些 ChIP 条件下,应使用 10 微克抗体。

值得注意的是,每个用户都要优化抗体用量,因为可能在其他用户的实验条件下 2 微克就够了,没有适用于每个人的标准用量。不同的抗体对其靶标有不同的亲和力,因此,我们可能需要在清洗步骤中对不同盐浓度进行实验。在大多数实验方案中,使用含 150 mM 氯化钠的缓冲液将抗体蛋白 DNA 复合物清洗三次,然后使用含 500 mM 氯化钠的更强效的清洗缓冲液清洗。使用强效清洗缓冲液时亲和抗体可能会与目标蛋白分离,所以需要用相对较低盐浓度进行实验,以确保不影响特异性抗体结合。这是举一个TBP 抗体,货号为ab818 的例子。当最终清洗液的盐浓度为 500 mM 时,特异性抗体 ChIP 与只用微珠的对照之间的区别较低,大约是六倍丰度。

但是,将最终清洗液盐浓度降低到 250 mM 时,特异性抗体结合率增加,然而背景并没有增加。我们应尽可能地优化清洗液中盐离子浓度,以得到高信噪比,同时不影响特异性抗体结合。接下来,我会重点说一些常见问题以及解决方案。我们可能在只用微珠或使用同型免疫球蛋白对照中观察到了高背景。这可能是蛋白 A 或 G 微珠有非特异性的结合。我们可以通过预清洗步骤进行改善。我们将微珠加入到样品中孵育一小时,然后在加入抗体前移除。这样我们可以消除对微珠的任何非特异性结合。ChIP 缓冲液也有可能被污染,所以我们需要制备新鲜的裂解缓冲液和清洗液。有些蛋白 A 或 G 微珠会产生高背景。我们可以尝试不同的微珠,使用在非特异性对照中能提供最清晰结果和低背景的微珠。我们可以考虑用磁珠代替琼脂糖、琼脂糖凝胶微珠,因为这可以降低结合到微珠的背景。

如果染色质碎片太大,大片区域中我们可能观察到低分辨率、高背景。在使用不同细胞时我们都要优化 DNA 片段化,因为超声处理和酶孵育条件都可能改变了。如果DNA 片段大小超过 1,500 对碱基对。我们要考虑增加超声处理或消化的时间。如果你们观察到所有样品的信号低,可能是染色质片段可能太小了。这时需要减少超声处理或消化的时间,将染色质片段大小增加到 500 对碱基对以上。用超声处理得到更小的片段可能会使核小体解离,因为核小体间 DNA 被消化了。我们用Ripa裂解细胞通常会得到较好的裂解效果。通常稍微提高裂解液中去污剂的浓度可能会改善信号。同时过度交联能降低表位的可及性,使得抗体结合率降低。如果进行交联ChIP,我们需要减少甲醛交联的时间,用 PBS 清洗细胞。有时我们还需要用甘氨酸来终止甲醛交联。

对于 ChIP我们也需要优化实验用的染色质的量。标准而言,每次 IP 我们使用 25 微克染色质,但这可能需要增加。同时我们也要优化抗体量,我们可以从3 至 5 微克抗体开始优化,但如果没有观察到信号或者观察到的信号低,我们就可以增加到 10 微克。清洗可能减弱特异的抗体结合;所以清洗缓冲液中所用的氯化钠浓度不要超过 500 mM,过于强效的清洗缓冲液会消除特异性抗体结合。通常我们使用含 250 mM 氯化钠的最终清洗液。有时候目标可能没有在目标区域富集,所以我们要设置一个阳性对照抗体来确认实验顺利进行。我们也需要选择合适的微珠,如果使用了错误的抗体亲和微珠,抗体不会结合。蛋白 A 和 G 是能以不同亲和力结合多种免疫球蛋白的细菌蛋白,所以有必要检查其相容性。如果没有同型结合偏好,我们可以使用偶联有蛋白 A 和蛋白 G 混合物的微珠。

如果抗原表位不可及或者发生变化,我们需要考虑更换抗体。如果进行的是交联ChIP,可以试一下 自然ChIP,因为表位在其天然形式下是可及的。如果进行的是 N-ChIP,靶标蛋白的 DNA 亲和力可能较低,或者不在组蛋白附近。可能需要交联来实现有效的 IP。免疫沉淀 DNA 可能存在 PCR 扩增问题,你们可能看到 PCR 后所有样品的信号增加,甚至包括不加模板对照。这可能是由于PCR体系受到了污染,我们需要重新配置新的体系。如果样品中没有 DNA 扩增,我们需要通过标准品和 Input DNA来确认引物是否工作正常,并针对过个位点设计 PCR 引物。基因组的某些区域会比其他区域纯化得更好,有些核小体可能在酶片段化过程中发生重排。现在,我把时间交给 Miriam,她会进一步介绍实验方案和我们的常见问题排除指南。

MF:谢谢,Karen。大家好,我想利用这次机会向各位介绍下 Abcam 为表观遗传学研究提供的一些资源和产品,重点讲讲 ChIP。大多数人可能都知道,我们的“ChIP 入门指南手册”对 ChIP 用户来说都极具指导意义。它包含了来自顶尖研究人员(包括我们的内部研发科学家)的建议和疑难问题解答,对整个实验的进行逐步指导。Karen 刚刚讨论的有些主题也包括在本书中。最近,我们加入了两大新应用,它们享受我们的 Abpromise质保。RIP 表示 RNA 免疫沉淀,CLIP 表示紫外线交联和免疫沉淀。这些都是以抗体为基础的技术,用来研究 RNA 和蛋白质相互作用。

如果您想了解这些应用的详情,请在 abcam.com/protocols 查阅我们的应用方案,或者在abcam.com/epigenetics 访问我们的表观遗传学微型网站。如果您对今天讨论内容或者 Abcam 产品有任何疑问,您可以随时联系我们的科学支持团队。他们很高兴为您解答任何问题。如果您在美国、加拿大或者南美洲,请联系我们的美国团队。如果您在中国香港、中国内地或亚洲,请联系我们的中国团队。如果您在英国或欧洲,请联系我们的英国团队。如果您在日本,请联系我们的日本团队。我还想强调一下,我们有多语种支持,所以请不要犹豫随时联系我们。正如我刚刚提到的,abcam.com/epigenetics 是我们最新的表观遗传学微型网站,这是一个包含遗传学相关的所有主题一站式服务点。在这个微型网站,您可以看到表观遗传学相关产品、实验方案、和即将举行的会议的最新消息。

如果您计划大量使用某个产品,您可能需要批量购买。批量购买能助您节省成本,将实验中的易变性降至最低。如果您希望了解我们所有的批量购买选项,请发邮件至 sales@abcam.com 联系我们的销售团队。现在,我想集中讲下 Abcam 新系列表观遗传学试剂盒,EpiSeeker 系列。这种试剂盒由研究人员精心开发而成,为您节省了做实验的时间,因此您可把更多时间花在实验设计和实验结果分析上。我们的 EpiSeeker 系列包含了多种不同产品,今天我只讲一下我们的 ChIP 试剂盒系列。要指出的是,我们所有的 EpiSeeker ChIP 试剂盒都用于交联 ChIP,不能用于自然 ChIP。我们的一步式 ChIP 和植物 ChIP 试剂盒分别为哺乳动物 DNA 和植物 DNA 而优化。这些试剂盒不含有任何抗体,所以适用于任何靶标。无论起始材料是细胞还是组织,EpiSeeker 系列也包含为甲基化或乙酰化修饰组蛋白优化的试剂盒。我们还有用于甲基化 DNA免疫沉淀的试剂盒,稍后我会稍微介绍下这种试剂盒。关于这些试剂盒及 EpiSeeker 产品的更多详情可以访问这里出现的页面链接 abcam.com/EpiSeeker。

那么用EpiSeeker ChIP试剂盒代替传统的 ChIP 方法有哪些好处呢?首先,反应在 96 孔板上进行,所以很容易标准化,也容易以高通量的检测方式进行。这种试剂盒只需要五小时,而使用传统实验方案则要耗费两天。除了交联步骤,它包含了 ChIP 反应所需的所有试剂。除了通用 ChIP 试剂盒,我们所有的 ChIP 试剂盒都包含针对检测进行了优化预选ChIP 级抗体。最后一点,同时也是非常重要的一点,一旦获得 DNA 沉淀,就可以直接用于下游实验。正如刚刚提到的,我们提供甲基化 DNA 免疫沉淀试剂盒。这两个试剂盒包含了甲基化和羟甲基化 DNA 的特异性抗体。这些修饰对基因差异表达发挥了重要作用,因此,有合适的工具来研究它们的功能很重要。我们的免疫沉淀试剂盒对于补充所有 DNA 甲基化实验也很有用,例如亚硫酸氢盐修饰试剂盒,无法区分 5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基胞嘧啶。

最后,我想感谢各位参与本次讲座,我们现在为所有的讲座参与者提供 EpiSeeker ChIP 试剂盒七五折的特别折扣。而且,如果您能给我们反馈这些 ChIP 试剂盒的数据,您还能以七五折的优惠购买到 ChIP 级一抗。本次讲座后,页面会跳转到我们的网站,您可以了解有关这次特别折扣的详情,也可下载本次讲座的视频。我就不再耽误了,将时间交给 Karen,她已经准备好回答我们在本次讲座中收到的问题了,非常感谢各位的关注。

KH:谢谢,Miriam。在讲座中我们收到了很多问题,现在我来回答其中一些问题。所有没有回答的问题会在讲座后通过电子邮件回复。其中一个问题来自 Maria,她问:是否有必要用甘氨酸来猝灭甲醛?是的,没有必要用甘氨酸来猝灭甲醛。但是如果我们用的组织样品太厚了,渗透很困难,交联时间可能要长一些,之后没有办法全部清洗干净,用甘氨酸来猝灭就很有用了。所以,对于没有使用细胞培养或细胞悬液的情况我们推荐用甘氨酸来淬灭。下一个问题来自 Aaron Dam,问到微球菌核酸酶消化是否可用于 ChIP 交联?是的,可以在交联后用酶来消化染色质。但由于蛋白质和 DNA 会交联,核酸酶渗透可能更难。我们需要进行一些优化来获得合适条件。

有个问题来自 Sallem,问你会为 X-ChIP 推荐哪种超声仪?根据我的经验,超声波水浴更好,因为它们具有更好的可重复性。与使用超声探头相比,几乎没有泡沫。超声过程中要保持样品低温;我们可以采用冰浴。为了使样品保持低温,超声处理时间要短,不要连续超声处理,中间要停一下;超声处理 30 秒,休息 30 秒,间歇性地处理。下一个问题来自 Jens:是否能用组织样品进行 ChIP?是的,可以。我们需要将组织磨得很细,制成单细胞悬液。就如我刚刚讲的淬灭,可能还需要延长交联时间,或增加甲醛的用量。在 Miriam 提到的实验方案书中详细记录了组织样品制备方法。制备好样品得到悬浮液后,就可以继续进行标准 X-ChIP 实验方案了。

那么,还有个问题来自 Nina,是关于 ChIP 中使用植物样品的问题,那有没有可能也将其作为一种样品类型?是的,这也是可能的。将幼苗作为样品,用杵和砂浆把材料磨碎,让样品分散。使用一系列提取缓冲液进行超声处理,按照标准 ChIP 实验方案继续操作。在我们的方案书中也有这种方案,也提供植物材料 ChIP 试剂盒,所以可以用它作为你的起始材料。下一个问题是关于对照,来自 Jan,如果一抗没有可用的 IG 对照,举个例子,是很罕见的一抗,应该用什么对照?可以用 IG 对照,也可以用只用微珠的对照,这会提供检测的背景。也可以用来自同种类的抗体或来源于亲缘关系较远物种的同型抗体。举个例子,样品中不会出现的表达标签,只提供一些背景水平并作为对照,所以这是你可以使用的。

这个问题来自 Todd,问有可能使用全抗血清抗体吗?是的,可以使用全抗血清抗体。但你要明白,使用这些抗体会得到高背景,因为在溶液中有非特异性抗体。如果这是唯一的选择,还是值得一试。你也可以考虑纯化全抗血清,得到 IgG 片段,这是更纯的产物。你可以使用蛋白 A 或蛋白 B 微珠。这绝对值得试一试,如果没有可选择的其他 ChIP 抗体或亲和纯化抗体。最后一个问题,来自 Joe,问如果一个抗体能用于 ChIP,那是不是也能用于 ChIP-seq?是的,可以。流程基本上一样,只是输出和分析不同。所以,如果一个抗体在 ChIP 中测试了,适用于这种检测,那么它也能提供适用于 ChIP-seq 的 DNA,所以答案是肯定的。我把时间交给 Lucy,再次感谢各位抽空参加今天的讲座,我们会尽快回复您提出的问题。

LP:大家好,感谢 Karen。我谨代表 Abcam 感谢各位参加本次讲座。希望大家能觉得有所收获,对您的工作有所帮助。没有回答的问题,我们的科学支持团队稍后会联系您,答复您的问题。刚刚进行的讲座可下载 PDF 版本。当您离开本次在线讲座页面时,会跳转至一个网页,在那里你可以下载本次讲座的 PDF,还有针对所有讲座参与者的 ChIP 试剂盒及抗体的独家促销信息。如果您有任何关于 ChIP 的问题或者需要科学咨询,就像之前提到的,我们的科学支持团队很高兴为您服务,请发送邮件至 cn.technical@abcam.com。如果您有任何有关在线讲座的问题,请发邮件至 cn.marketing@abcam.com 联系 Abcam 活动团队。最后,我们始终欢迎对我们在线讲座的反馈,非常感谢您能抽时间完成简短的反馈调查,当您从本次在线讲座注销时,屏幕上会弹出反馈调查问卷。希望能在下一次在线讲座中再次与您相约,再次感谢各位的参与,祝各位研究顺利。


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