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ChIP实验方案优化及疑难解答网络研讨会

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许多实验室都在进行染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验,但是实验方案的优化才是成功的关键。

了解 ChIP 为什么是如此有用的实验室技术以及如何优化您的实验方案,并与我们的表观遗传学专家探讨关键疑难解答技巧。

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网络研讨会主题:

  • 染色质基础
  • ChIP 为什么是如此有用的实验室技术
  • 实验方案优化的重要性和最佳结果
  • 关键疑难解答提示

主讲人简介:

David Grotsky 在圣路易斯华盛顿大学取得了分子遗传学和基因组学博士学位。他的博士论文重点研究 DNA 修复因子的调控以及其对肿瘤细胞的基因组稳定性和增殖的影响。

David 目前是 Abcam 技术支持团队的表观遗传学专家。

ChIP 方案优化及问题解答


大家好,我是 David,感谢各位今天参与我们的讲座。今天我要讲的主题是ChIP 方案优化及问题解答。

本次在线讲座的主要内容有以下四个方面。首先我会介绍染色质的结构和组蛋白修饰,然后简要概述 ChIP 的用途。接下来,我会讲讲 ChIP 方案,详细介绍如何优化 ChIP 方案并解答问题。

我们先从染色质讲起。在人类基因组中,有大约 32 亿个 DNA 碱基对,如果全部展开的话,每个细胞中的 DNA 长约 5 英尺。因此,DNA 只有被紧密地压缩成一个称为染色质的高阶结构,细胞核才可以容纳 DNA。染色质也是控制基因表达的一个重要因子。核小体是染色质的基本结构单位,每个核小体由146bp的DNA缠绕组蛋白八聚体近两圈形成。核小体由H2A、H2B、H3、H4 四种组蛋白组成,每种组蛋白各有两个拷贝。组蛋白 H1 位于该结构的顶部,用于固定缠绕的 DNA。在串珠结构上的一串珠子是常染色质。当多个核小体进一步压缩,缠绕成 30 nm 的纤维,就形成异染色质。最后,在有丝分裂中通过更高水平的包装形成中期染色体。

我之前提到的组蛋白可能有很多翻译后修饰,这会影响他们与 DNA的 相互作用。特异性修饰对基因转录有不同影响,构建了一种组蛋白编码,这种观念在二十一世纪早期很流行。组蛋白 H3 和 H4 是最常见的修饰组蛋白,组蛋白的 N-端尾部从核小体的中心向外延伸,大量氨基酸残基就很容易被化学基团所修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、脱氨与泛素化。乙酰化通常与基因激活相关,而不同的特异性甲基化修饰通过放松或浓缩染色质,控制转录因子与基因的启动子区域结合从而参与了基因激活或抑制。染色质免疫沉淀的出现,使得准确研究这些修饰组蛋白以及转录因子在基因组的结合位点成为可能。

ChIP 是我们在特定的细胞状态、条件或时间点对细胞内 DNA 和蛋白质之间的直接的相互作用进行测量的实验。正如刚才提到,ChIP可以用来确定修饰组蛋白在基因组中所在的位置以及转录因子与启动子及其他 DNA 的结合位点。为了进行 ChIP,我们需要使用抗体来结合连接到 DNA 的蛋白质。现在给大家看一个 ChIP 实验的例子,我们利用H3K4三甲基化组蛋白抗体进行了ChIP实验。H3K4三甲基化组蛋白与基因激活相关,所以我们可以看到在 3 个活性基因中看到该修饰组蛋白富集,但在3 个非活性基因中并没有富集。这里我们是通过ChIP-PCR一次对一个基因或位点进行分析,除此之外我们还可以通过ChIP芯片或ChIP测序在基因组水平上进行分析。

ChIP 是一个非常强大的工具,可以产生非常多的数据。现在请大家看一个活性基因的表观遗传学数据,这些数据是通过进行 ChIP 测序分析数千个已知活性基因获得的,以确定修饰组蛋白结合位点。转录发生时,随着聚合酶沿着 DNA 移动,组蛋白修饰剂引入并激活修饰组蛋白。启动子区域有非常明确的染色质标记,核小体缺失区域非常清晰,聚合酶在这里结合并极大地促进了对 H3K4 甲基化和乙酰化组蛋白的激活。随着转录沿基因继续下去,修饰剂引入新的修饰物,让聚合酶沿着 DNA 移动。

基因组水平的 ChIP 研究大规模地揭示了在不同基因组元件上的表观遗传学特征。这里我列举了一些修饰组蛋白,其中有结合在启动子上的特异性修饰组蛋白,这取决于启动子是否处于活跃、稳定或不活跃的状态;还有结合在基因内的特异性修饰组蛋白及结合在增强子的修饰组蛋白。正如我们之前看到的,H3K4 甲基化和乙酰化组蛋白结合在活性启动子和增强子上,而 H3K9二甲基化和三甲基化组蛋白结合在非活性基因中。

接下来我想再简要讲一讲ChIP实验方案。ChIP分为交联 ChIP 和自然 ChIP。在交联 ChIP 中,利用甲醛将 DNA 与蛋白交联,裂解细胞,然后 DNA 经超声处理成 200 至 1000 个碱基对的随机片段。在自然 ChIP 中,DNA 和蛋白没有交联,用微球菌核酸酶消化 DNA,能产生单个核小体水平或者约 150 到 175 个碱基对的 DNA 片段。接下来,加入目标特异性抗体来结合蛋白 DNA 复合物,然后进行免疫沉淀,把直接与目标蛋白结合的 DNA 片段拉下。如果做交联 ChIP,随后会进行解交联,纯化DNA,接下来通过 ChIP-PCR、ChIP芯片或ChIP测序来进行后续分析。拉下的 DNA 丰度可以与input,即使用的染色质数量进行比较。

自然 ChIP 和交联 ChIP两种方式,各有优缺点。利用自然 ChIP,我们通常可以获得更多 DNA 和蛋白质的更有效沉淀;因为结合更可预测,特异性也更高。分辨率也更高,低至单个核小体。而交联ChIP通过超声处理得到的片段为 200 至 1000 个碱基对。自然 ChIP 的一个缺点是它只能用于组蛋白,因为 DNA 与这些蛋白作用紧密。如果我们想做转录因子的 ChIP,由于它们与 DNA 的结合并不强,我们必须要进行交联,以确保与蛋白 DNA 的相互作用保持完好。另一个缺点是核酸酶的消化是选择性的,这种消化可能对染色质有偏好,还有可能发生染色质重排。当然,如果我们使用了太多核酸酶,也可能对染色质消化过度。另一方面,交联 ChIP 要灵活得多,可对所有细胞类型、组织和有机体中的组蛋白和非组蛋白进行ChIP实验。除了分析DNA-蛋白相互作用,我们还可以分析 RNA-蛋白、更高次序的蛋白-蛋白-DNA 相互作用;同时染色质重排的概率下降。当然,交联 ChIP 也有多个缺点,包括过度固定会妨碍超声处理效率;甲醛处理后不可进行酶消化;甲醛可以影响抗原结合;因为不能使用微球菌核酸酶进行消化,交联ChIP比自然 ChIP 的分辨率低。通过上述分析,希望现在大家能确定自然 ChIP 或交联 ChIP 中哪种更适合自己的实验。

现在,我想讲一讲优化方案,先说说如何选择合适的抗体。大多数抗体不适合 ChIP,所以我们要寻找适合 ChIP 的抗体。我们要进行特异性测试,例如肽阵列数据。这是我之前展示过的 H3K4 三甲基化组蛋白抗体,我们可以看到该抗体与 K4 三甲基化肽段紧密结合,而与所测试的其他肽段不结合,或者结合很少,说明了该抗体对H3K4三甲基化修饰具有特异性。

如果没有测试过ChIP 应用的抗体,但我们又想试一下,那可以看看已经测试IP、IHC 或 ICC 应用的抗体。因为与 ChIP 相似,这些应用能识别蛋白质的天然构象,而不像western blotting中抗体可能只识别变性蛋白。如果想在 ChIP实验中用一种 Abcam 的抗体,可以使用我们的 Abtrial 测试项目,这个我们稍后会进一步讨论。

最后,关于抗体克隆性,单克隆抗体和多克隆抗体都各有其优缺点。多克隆抗体识别多个表位,这对交联 ChIP 来说很不错,因为这种实验中表位可能被遮挡,但它们存在批次间差异。单克隆抗体只识别一个表位,所以如果表位被遮挡,抗体就不会结合,但是批次间差异很小。

我们有很多 ChIP级的多克隆抗体,现在也在开发用于 ChIP 的高度特异性兔单克隆抗体。优化 ChIP 方案的最重要步骤是从真正不错的染色质模板和正确的片段大小开始。对于交联 ChIP 来说,这意味着需要确定合适的交联和超声时间,对自然 ChIP 来说,这意味着需要确定合适的核酸酶用量和消化时间。交联ChIP中,我们需要设置一个时间段来确定交联的最佳时长,可能介于 2 到 30 分钟之间,但通常 10 到 15 分钟就足够了。得到合适的片段大小是至关重要的,我们必须尝试不同的超声处理次数,然后将 DNA 纯化跑胶,确定多少次超声处理可以达到最合适的大小。我们通常希望得到 200 到 1000 个碱基对的碎片大小。对于自然 ChIP,我们可以得到约 175 个碱基对的片段。

接下来,我们需要确定 ChIP 中所用抗体的合适用量。一般来说,每 25 ug 染色质约 4 ug 抗体比较合适,但是需要调节抗体用量来提高信噪比。清洗缓冲液的成分很重要,我们应该确定氯化钠和氯化锂的合适用量,来提供适当的强度。一般使用浓度是 250 到 500 毫摩。如果清洗缓冲液不够强,那么就会导致高背景,而太强的缓冲液又会破坏特异性抗体的相互作用。

由于 ChIP 比较难,也很费时间,所以有合适的对照来确定实验是否正常进行很重要。这些对照包括了阴性 IP 对照,如同型 igG 对照或只用磁珠的对照;qPCR 的阳性和阴性位点对照,即已知蛋白会结合或者不会结合的区域或基因位点对照;以及 qPCR 的非模板对照,以确保 PCR 中没有污染。

阳性对照特别重要。如果我们研究活性位点,我们可以使用能识别 H3K4 三甲基化或 H3K9 乙酰化组蛋白的抗体,如果我们研究的是抑制位点,我们可以用能识别 H3K9 三甲基化或 H3K27 三甲基化组蛋白的抗体。我们也可以使用H3组蛋白 抗体,H3组蛋白无处不在。这里我们可以看到,H3K4 三甲基化组蛋白存在于活性位点,H3K9 三甲基化组蛋白存在于异染色质。

现在开始问题解答。如果在非特异性抗体对照中有高背景,应该怎么办?这可能是同种型 igG 对照或只用磁珠的对照有非特异性结合,我们总是推荐进行预清理的步骤。您的清洗缓冲液也可能受到污染,所以最好总是用新鲜的缓冲液,或者在得到高背景时更换缓冲液。有些磁珠本来就有高背景,所以可以试试不同的磁珠和不同的封闭策略,来看看哪一种在非特异性对照提供了最低的背景。

如果在大片区域得到高背景、低分辨率,应该怎么办?这最可能是由于 DNA 片段太大了。片段不要超过 1500 个碱基,理想情况下是介于 200 至 1000 个碱基对之间。如果可以做自然 ChIP,那就能得到单个核小体的最佳分辨率。

如果没有得到信号或者信号弱,应该怎么办呢?那么有很多方面需要注意。比如DNA 片段可能太小,可以通过跑胶看看它们是否是正确的大小。如果进行的是交联 ChIP,细胞交联太久可能降低表位的可及性,所以要优化交联时间,用甘氨酸终止交联。信号弱也有可能是起始材料不够导致的,每个ChIP 通常需要大量的上样量,通常是25 ug 染色质,或者3 到 4 百万个细胞。也可能是抗体用量不足导致的,通常3 至 5 ug抗体就足够了,但是如果信号低或没信号,最多可能需要10 ug抗体。

信号弱还有可能是清洗缓冲液太强,清除了特异性抗体结合,不要用超过 500 毫摩的氯化钠或氯化锂。同时要确保细胞是充分裂解的,RIPA之类的裂解缓冲液通常效果不错。要记住,如果在目标区域没有抗体富集,我们的结果也可能就是这样的。一定要有阳性对照抗体和位点,以确认 ChIP 实验正常进行。

要确保自己知道何时用自然 ChIP,何时用交联 ChIP。分析 DNA 亲和力较弱的蛋白时,交联 ChIP 更适合,所以可能要进行交联来保证蛋白与 DNA 相连;只有在研究组蛋白时才能进行自然 ChIP。如果您用的是单克隆抗体,它可能因为表位遮挡而不适合于交联 ChIP,因为有表位遮挡,所以试试已进行过 ChIP 测试的抗体或者多克隆抗体。同时要确保您用的是正确的亲和微珠,要确保抗体种类和免疫球蛋白能结合到所选的微珠,或者直接使用偶联ProteinA/G 混合物的微珠。

关于PCR 扩增的问题。如果 PCR 之后所有样品都得到了高信号,包括非模板对照,您的 pcr 溶液可能被污染了,所以应该用新配置的溶液。如果在样品中没有得到扩增,要确保加入标准品或上样 DNA,以确认引物在工作。

现在,我想向各位介绍 Abcam 提供的有助于科学家研究的资源。我之前提到了 Abtrial 项目,这个项目中,您可以在未经测试的应用或物种中使用我们的产品,没有财务上的风险。如果您希望在 ChIP 中试用一种我们还未测试的抗体,这是个很好的项目。如果您通过 abreview 给我们发送您的结果,无论是阳性结果还是阴性结果,我们都会给您提供一个折扣码,可用于将来订单中的全额产品。如果您希望参与这个项目,可以访问 abcam.cn/abtrial,或联系我们的科学支持部门。我稍后会给出我们的全球科学支持联系信息。

我们也有 abreview 项目,这些是客户提供的用户评论,指出他们用该产品做了什么实验及实验结果。大家可以提交关于我们任何产品的评价,进行 1 星到 5 星的打分,无论好坏,我们会公布所有的评价。这里我们可以看到 H3K9 乙酰化抗体有 32 个评价,如果您点击这里的链接。

您可以看到每个评价的具体方案信息和图片,同时可以按应用、物种、得分过滤评价。

最后,我们是来提供帮助的!如果您对我们的产品有任何问题,请随时通过电子邮件或电话联系我们,我们在全球提供多语种支持。还请记住,我们所有产品都受到 Abpromise 保证,如果您在经测试的应用和物种中使用产品,它却没有按照数据表上所描述的那样起作用,只要告诉我们,我们会帮助您使用产品,或者给您换货或退款。

谢谢大家参与我们的在线讲座。






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