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ChIP应用网络研讨会

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 与我们的表观遗传学专家一起探讨表观遗传学、ChIP 和组蛋白修饰

本次研讨会将简要介绍染色质和 ChIP 实验方案,其中包括相关文章中的亮点,在这些文章中 ChIP、ChIP-on-chip 和 ChIP-seq 用于定位基因组区域和组蛋白修饰。 

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网络研讨会主题:

  • 染色质和 ChIP 简介
  • 组蛋白密码假说
  • 我们从 ChIP-on-chip 中学习到了什么
  • 我们从 ChIP-seq 中学习到了什么
  • ChIP 的变化

主讲人简介:

    David Grotsky 目前是 Abcam 的表观遗传学专家,

    他在圣路易斯华盛顿大学取得了分子遗传学和基因组学博士学位。他的博士论文重点研究 DNA 修复因子的调控以及其对肿瘤细胞的基因组稳定性和增殖的影响。

     ChIP 应用”在线讲座


    欢迎参加 Abcam 的“ChIP 应用”在线讲座。今天的主讲人是 David GrotskyDavid 在圣路易斯华盛顿大学取得了分子遗传学和基因组学博士学位。他的博士论文重点研究 DNA 修复因子的调控以及其对肿瘤细胞的基因组稳定性和增殖的影响。David 目前是 Abcam 科学支持部门的表观遗传学专家。今天和 David 一起进行讨论的还有 Abcam 一抗产品经理 Ken HamillKen 已经在 Abcam 工作七年了。他毕业于麻省理工学院生物化学系,随后在波士顿大学获得了工商管理硕士学位。现在就由 David 开始本次在线讲座。

    DG:感谢 Vicky,非常感谢大家参加这次在线讲座。我想简单介绍本次在线讲座的主要内容。我首先要介绍染色质结构,然后简述 ChIP实验方案。接下来我要介绍在 2000 年首次提出的组蛋白密码假说,然后讲解 ChIP-qPCR 数据,再回顾一些采用 ChIP芯片分析染色质修饰和基因组结构的论文。接下来,我将讨论一些使用 ChIP-测序技术的论文,最后讲一下由 ChIP 实验方案延伸而来的最新实验方案。

    那么,什么是染色质?在人类基因组中,有大约 32 亿个 DNA 碱基对,如果全部展开的话,每个细胞中的 DNA 长约 5 英尺。因此,DNA 只有被紧密地压缩成一个称为染色质的高阶结构,细胞核才可以容纳 DNA。染色质也是控制基因表达的一个重要因子。核小体是染色质的基本结构单位,每个核小体由146bpDNA缠绕组蛋白八聚体近两圈形成。核小体由H2AH2BH3H4 四种组蛋白组成,每种组蛋白各有两个拷贝。组蛋白 H1 位于该结构的顶部,用于固定缠绕的 DNA这种“串珠”结构称为常染色质。当多个核小体进一步压缩,缠绕成 30 nm 的纤维,就形成异染色质。最后,在有丝分裂中通过更高水平的包装形成中期染色体。  

    我之前提到的组蛋白可能有很多翻译后修饰,这会影响他们与DNA的相互作用。组蛋白H3H4是最常见的修饰组蛋白,组蛋白的 N-端尾部从核小体的中心向外延伸,大量氨基酸残基就很容易被化学基团所修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、脱氨与泛素化。也有一些组蛋白变体修饰,比如组蛋白H2AX139位丝氨酸磷酸化,可作为DNA损伤标记物。特定修饰对基因转录有不同的影响,我们稍后会讲到。    

    为确定修饰组蛋白以及其他蛋白-DNA相互作用位点,开发了染色质免疫共沉淀 (ChIP) 技术。ChIP中,用甲醛将 DNA 交联到蛋白质上随后再通过超声处理将 DNA 打碎成含 200-1000 个碱基对的片段。在某些情况下,当蛋白质与 DNA 的结合相当紧密时(比如核小体),则无需进行交联,这叫做自然 ChIP。在自然 ChIP 中,使用微球菌核酸酶将 DNA 分解为单核小体大小的 DNA 片段。接下来,添加靶标的特异性抗体,使其与靶蛋白- DNA 复合物结合,只把直接结合到靶蛋白的 DNA 片段拉下来。 经过几轮清洗后,逆转交联,消化蛋白质和 RNADNA 可以被纯化用于后续分析。通过与 Input DNA 含量或起始染色质含量进行比较来确定拉下来的 DNA 丰度。

    现在我们大概了解了 ChIP,我想展示 1988 年的一个早期 ChIP 实验,这是第一批确定组蛋白乙酰化和转录激活之间关系的研究之一。在这里,作者开发和分出了一个抗H4乙酰化组蛋白特异性的兔源抗体。从 15 日龄鸡胚红细胞中分离出染色质,并用微球菌核酸酶片段化DNA。用抗体孵育后,因为这时还没有protein A protein G 磁珠,作者用福尔马林固定的金黄色葡萄球菌细胞进行免疫沉淀,因为该细胞外膜具有活性protein A。然后他们对 DNA 进行点杂交,每个点统一上洋量为500 ng DNA,并用α-D-globlin探针进行 Southern 印迹杂交。α-D-globlin在这些细胞中被转录激活。如图第 5 列所示,作者在含有H4乙酰化组蛋白抗体的结合组分中发现了非常高的 α-D-globlin信号,这表明H4乙酰化组蛋白结合于非常活跃的基因位点。

    因此,在我刚刚展示的这个图的第一部分,作者发现H4乙酰化组蛋白结合于活性 α-D-globlin基因位点。他们将这些结果与失活的ovalbumin基因位点进行了比较。正如您在第 5 列看到的,和 Input 相比,结合组分中未发现增强的ovalbumin信号,这表明H4乙酰化组蛋白 不结合ovalbumin位点。这些结果表明, H4乙酰化组蛋白结合在进行活性转录的基因而不是失活基因。

    我展示的这项研究以及许多其他研究表明,不同的修饰组蛋白与转录激活和抑制特异性相关,科学家们开始好奇,这些修饰是否会在基因组结构和功能中起到更多作用。所以在这里我想介绍一个概念,即 2000 年由 Brian Strahl David Allis 第一次提出的组蛋白密码假说。这一假说提出,特定的修饰组蛋白将有助于招募其他蛋白质来改变染色质结构或影响转录。在这个概念中,他们给出了当时功能已知的常见修饰组蛋白,以及有相互作用的所有已知蛋白质。事实证明,最初提出的组蛋白密码是非常复杂的,影响蛋白质招募和转录调控的修饰组蛋白有非常多可能的组合。目前为止,科学家们已经取得了巨大的进步,并鉴定出了许多组蛋白翻译后修饰的功能,而组蛋白密码假说至今还是备受争议的研究热点。 

    随着新技术的涌入,我们已经能够利用 ChIP 进一步研究修饰组蛋白和其他 DNA 结合蛋白的功能、以及整个基因组结构。分析 ChIP 数据的最常用方法包括ChIP-qPCRChIP-芯片、ChIP-测序。   

    我想简要介绍一个从 qPCR 获得的 ChIP 结果的例子。在这里,我将展示经我们实验室测试的H4K8乙酰化组蛋白抗体的数据。拉下结合H4K8乙酰化组蛋白的 DNA 后,用引物 qPCR 扩增 左边三个具有转录活性的基因和右边三个无转录活性的基因。H4K8乙酰化组蛋白与基因激活有关,所以你可以看到,乙酰化组蛋白的三个活性基因的 Input 对比丰度高于失活基因。ChIP-qPCR 是目前最常见的 ChIP 实验分析方式,主要针对特定的PCR 位点。 

    我们可以使用 ChIP芯片进行全基因组 ChIP 分析,如图所示。在 ChIP芯片中,我们可以利用微阵列技术在整个基因组中确定H3K4三甲基化组蛋白的存在与否。在 ChIP芯片中,ChIP实验过程正常执行,直到 DNA 纯化出来。在这时,免疫沉淀的 DNA 被扩增并标记上Cy5荧光探针。Input DNA 也被扩增并标记上Cy3荧光探针,两组标记 DNA 同时结合并杂交至对应的特定结构域、目标基因位点、甚至是全基因组的微阵列上。通过 ChIP DNA input DNA 的荧光标记信号比率可以识别富集区域。

    这里有一个早期 ChIP芯片实验案例。作者分析了酿酒酵母全基因组的乙酰化和甲基化组蛋白模型。他们使用靶向H3H4乙酰化组蛋白 和H3 K4二甲基化组蛋白的抗体进行染色质免疫沉淀。本研究中所用的微阵列适用于编码区的开放阅读框,或含有该基因启动子的基因间隔区。这个图表明,H3 H4 乙酰化组蛋白在启动子区富集程度最高,在编码区的富集程度也很高,而组蛋白 H3K4二甲基化组蛋白不在启动子区富集,但在编码区的富集程度较高。 

    由于这是一个早期的 ChIP芯片实验,他们使用了传统的 ChIP-PCR来验证结果,这是普遍有效的方法。他们在靶向活性转录基因 SUB2MNN9YHM2进行 ChIP-PCR,在 A 图可以看到, H3乙酰化组蛋白在SUB2启动子区的富集程度高于编码区,而H3K4二甲基化组蛋白在SUB2编码区的富集程度高于启动子区。B 图中 MNN9 YHM2 的情况也相同,这验证了 ChIP芯片实验所发现的结果。

    几年后,改进后的 ChIP芯片可提供更高特异性和更高分辨率的结果。在这篇论文中,作者使用 ChIP芯片鉴定了人类基因组中的活性启动子。他们定位了 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录前起始复合物的结合位点,这个复合物包括 RNA 聚合酶 Ⅱ、TFIID和其他通用转录因子。他们采用识别TFIID复合体中 TAF1 亚基的抗体对 TFIID 结合 DNA 进行染色质免疫沉淀,然后通过微阵列杂交展示出人类基因组中的所有非重复 DNA,结果发现了 12150 TFIID 结合位点。你可以在 B 图中看到一个数据案例,最高峰对应基因的转录起始位点,另外我们将TCFL1基因位点处放大可以看到TCFL1启动子处的峰图。

    研究人员将 ChIP 得到的 TFIID 结合位点与已知转录的 5’端相匹配,发现其中 83% 是位于转录起始位点附近500 对碱基对内,如图 C 所示。这 9328 DNA 序列被定义为启动子。如图 D 和图 E 所示,这些启动子匹配到 8960 EnsEMBL 基因和 5118 个已知启动子。进一步分析后,作者定义了 1239 个可能启动子,这些启动子不能匹配到已知的转录单位。如图 F 所示,这些预测的启动子的大部分都显著富集已知的启动子序列,如 CpG 岛、起始因子和下游的启动子元件。

    有趣的是,这项研究还表明,许多基因含有两个或两个以上的活性启动子。该图作者深入解析了 WEE1 基因,你可以看到有 2 TFIID 结合位点。每个启动子对应不同 mRNA 转录物的 5’端,第一个转录物编码全长 WEE1 基因,而另一个转录物仅编码激酶结构域。如图 B 和图 C,在 IMR90 细胞不同时期群体和细胞周期同步化群体中对两个转录物进行检测,较短的转录物在 G0 期更丰富,而较长的转录物在 G0 S 期最常见。这些结果表明,WEE1 基因的这两个启动子可能具有不同的细胞周期功能。

    在另一项非常有趣的研究中,ChIP芯片被用来反映修饰组蛋白与启动子的结合。在这篇论文中,研究者采用了 ChIP芯片分析人类基因组的 30 兆碱基,探究启动子和增强子区域的染色质特征。他们观察了核心组蛋白 H3 和其他五种修饰组蛋白:H3乙酰化组蛋白、H4乙酰化组蛋白以及H3K4单、双、三甲基化组蛋白。他们也对 RNA 聚合酶 II TAF1 进行了 ChIP用于识别活性启动子,正如我前面提到的,TAF1 TFIID 转录因子的最大亚基。他们同时对 P300 进行 ChIP 来识别活性增强子。图 A 显示的热度图中红色是富集区域,图 B 显示的是四类基因基于转录活性的热度图量化,其中 P1 是低转录,P4 是高转录。作者发现RNA聚合酶IITAF1结合的转录起始位点附近的谱峰为双峰分布。从图中可以看到,启动子附近没有H3组蛋白的结合,说明转录调控因子结合位点缺乏核小体。此外,你可以看到H3K4组蛋白依次由单甲基化转变为双甲基化、三甲基化时,富集的DNA在起始位点下游区域向起始位点靠近。从图中我们还可以看到H3乙酰化组蛋白和H4组蛋白的富集。

    为了研究增强子处的染色质特征,作者观察了 p300 结合富集 DNA 附近 10000 个碱基区域。P300 是能够结合增强子的乙酰转移酶。从数据中我们看到,在增强子处没有H3 组蛋白的结合,这表明该位点缺乏核小体,这与我们在启动子处的观察结果类似。H3K4 单甲基化组蛋白显著富集在所有缺乏H3K4三甲基化组蛋白富集的增强子处,这与我们在启动子处的观察结果有很大的不同。在一些增强子中,H4乙酰化、H3乙酰化和H3K4二甲基化组蛋白均有不同程度的富集,RNA 聚合酶 II TAF1以较低程度存在。然后,作者使用这些在启动子和增强子处发现的染色质特征来高准确性地预测这些原件在基因组中的位置

    ChIP芯片有一些局限性,但随着技术的进步,这些问题将不再是问题。 首先,ChIP芯片实验需要大量的细胞。  其次,ChIP芯片对人类基因组中的所有重复序列不敏感另外,要想覆盖整个基因组必须进行大量的微阵列。最后,ChIP芯片可能会受到 DNA 扩增后的扩增偏倚影响而后,在 2007 年研发出了 ChIP -测序技术,成为全基因组分析的一个非常强大的工具。我从首次描述该项技术的论文中提取了 ChIP-测序流程图。作者用微球菌核酸酶分解染色质后进行自然 ChIP,我不得不插一句,这个研究中的大多数抗体都来自 Abcam。免疫沉淀后收集 DNA,将接头加到 DNA 末端,然后进行限制性 PCR 扩增和聚类,最后则是下一代测序。产生的短序列可以比对到基因组。

    ChIP芯片相比,ChIP测序最大的区别和最好的改进就是 ChIP芯片无法比拟的碱基对分辨率。ChIP测序也避免了我之前提到的 ChIP芯片的许多局限性。在图中我们可以看到黑腹果蝇细胞中染色质蛋白 Chromator 的结合位点。你可以清楚地看到,上方蓝色图片中的 ChIP芯片数据峰值更宽,而红色图片中 ChIP测序数据峰值更窄、碱基对分辨率更高。

    如果我们回到 2007 年的这篇 ChIP测序论文中,可以看到修饰组蛋白的高分辨率图谱。作者将修饰组蛋白与其他一些蛋白质(如 RNA 聚合酶 II)的结合,与人CD4 阳性 T 细胞已知表达水平基因联系起来。他们将基因按表达水平分为高、中、低或沉默基因,由不同的颜色表示,并且将其相对于转录起始位点排列。这数据和 ChIP芯片的结果非常类似:转录起始位点缺乏核小体,修饰组蛋白的双峰分布在起始位点附近,以及修饰组蛋白结合偏向起始位点的 5’端。我们再一次看到,从转录起始位点开始存在着 H3K4组蛋白由三甲基化向二甲基化、单甲基化结合的转变。如图 E 所示,H3K27 三甲基化组蛋白果然在失活启动子处富集,但有点出人意料的是,如图 F 所示, H3K27单甲基化组蛋白结合于活性启动子中。 

    在这个图中,作者将修饰组蛋白与表达水平关联起来。他们根据表达水平将基因分成 100 组,可以看到从左到右按表达水平高低画出的黑虚线。然后,每个修饰组蛋白标签密度相对于表达水平作图。在图 A 中,大家可以看到 H3K4 的所有甲基化修饰与基因激活相关,修饰组蛋白标签密度随着表达水平下降而下降。H3K27 二甲基化和三甲基化组蛋白与基因抑制相关,而H3K27单甲基化组蛋白则与基因激活相关。H3K36 三甲基化组蛋白也与基因激活相关,而 H3K79 三甲基化组蛋白与基因抑制相关,这有些出人意料,因为这个修饰组蛋白与酵母中的基因激活相关。

    整合我迄今提出的数据和所有关于修饰组蛋白的证据,可以勾画出修饰组蛋白的“仪表盘”。这里我列举了一些修饰组蛋白,其中有结合在启动子上的特异性修饰组蛋白,这取决于启动子是否处于活跃、稳定或不活跃的状态;还有结合在基因内的特异性修饰组蛋白及结合在增强子的修饰组蛋白。正如我们之前看到的,H3K4 甲基化和乙酰化组蛋白结合在活性启动子和增强子上,而 H3K9二甲基化和三甲基化组蛋白结合在非活性基因中。此外还有其他标志着大规模抑制的基因组学特征,可以通过对 DNA 甲基化、核纤层结合结构域、多梳体和 LOCKs 或大型染色质 K 修饰等实施 ChIP 来进行测量。

    ChIP 是一个非常强大的工具,可以产生非常多的数据。现在请大家看一个活性基因的表观遗传学数据,这些数据是通过进行 ChIP 测序分析数千个已知活性基因获得的,以确定修饰组蛋白结合位点。转录发生时,随着聚合酶沿着 DNA 移动,组蛋白修饰剂引入并激活修饰组蛋白。启动子区域有非常明确的染色质标记,核小体缺失区域非常清晰,聚合酶在这里结合并极大地促进了对 H3K4 甲基化和乙酰化组蛋白的激活。大家可以清楚地看到,通过所有 ChIP芯片和 ChIP测序数据给我们提供的大量信息,可以了解基因组不同部分发生的修饰组蛋白结合情况。

    一个名为“encode”的大型项目代表了 DNA原件的百科全书,一直致力于促进多个研究小组与国家人类基因组研究所的合作。这个项目的目标是建立一个人类基因组中功能元件的综合列表。你可以通过 UCSC 基因组浏览器浏览数据。在这里,我们看到伸展开来的 21 号染色体,在下面您可以看到上面红色标记位置存在的基因,内含子和外显子分别被标出,还可以看到 SNPsRNA转录水平、H3K27乙酰化ChIP数据、DNase 1 超敏位点、转录因子 ChIP 数据等信息。您可以选择您想要和不想要的信息。

    encode项目还有一个目标,就是创建 ChIP测序指南来规范所有这一类型的实验。他们建议在 ChIP测序前进行严格的一抗鉴定。测序深度也很重要,该协会建议的最少为 2000 reads实验的重复性显然是重要的,他们建议至少进行两次实验以确保再现性。该协会也有质量控制指南,推荐使用交叉相关分析来评估 ChIP测序实验中的信噪比。最后,他们推荐使用 ChIP测序数据报告指南来确保所有实验室之间实现数据共享。他们指出,所有的 ChIP测序数据都应提交至公共数据库。

    到目前为止,我已经介绍了 ChIP-qPCRChIP芯片、ChIP测序及这些 ChIP 数据的读取结果。现在我想介绍一些最近出现的 ChIP 延伸实验方案。自第一次引入 ChIP 应用以来其主要问题是,每次实验需要大量初始细胞和染色质,但是现在abcam提供一套能够以极低的细胞数进行 ChIP 的试剂盒和实验方案。ChIP 的另一个问题是,每个实验的周期长达数天,现在abcam有一种试剂盒能让你在 5 小时内就完成 ChIP

    ChIP-loop ChIP 和染色质构象捕获的结合,通常被称为 3C3C 用于识别长片段 DNA 的相互作用,有了 ChIP-loop 你可以找出由特定目的蛋白介导的相互作用。首先进行细胞交联、DNA 限制性酶切,然后利用抗体对染色质进行免疫沉淀。随后连接 DNA 片段,逆转交联,然后再进行 DNA 纯化。最后可通过 qPCR 检测相互作用。

    ChIA-PET是指用配对末端标签测序法进行染色质相互作用分析。这基本上是全基因组 ChIP-loop。在连接步骤,链接序列被添加到 DNA 末端以创建相互作用区域库,然后可以使用下一代测序进行测序。

    ChIP-exo 可通过移除任何不直接结合蛋白质的 DNA,精确检测结合到单核苷酸上的蛋白质。免疫沉淀后,向 DNA 添加 PCR 接头,用 5’端到 3’端外切酶分解蛋白质 - DNA 复合物中突出 DNA 5’端尾巴。发生逆转交联后,再利用第一个接头的引物扩增 DNA。向 5’端添加第二个接头,并对产物进行测序。接头之间的所有序列都是目标蛋白的精确结合位点。

    最后是 ChIP-BS-seq,该方法是在 ChIP 后进行亚硫酸氢盐测序,以查看特定修饰组蛋白或目标染色质结合蛋白区域的 DNA 甲基化。完成 ChIP 后,DNA 经亚硫酸氢盐处理并进行测序。 

    现在大家可以看到,基于 ChIP 衍生出的一些激动人心的新方案,成为了科学家们研究 DNA - 蛋白质相互作用的强有力的工具。我要感谢大家参加此次在线讲座,我希望这次讲座对大家是一次有趣和翔实的体验。现在,就由 Ken 向大家介绍一些优秀的 Abcam 表观遗传学产品。Ken 的介绍结束后,我会回来回答你们的一些问题。 

    KH:谢谢 David 这么清晰的介绍。我相信听众会提出很多有趣的问题。现在我想花几分钟时间介绍一些 Abcam 为研究者们提供的激动人心的 ChIP 产品,并且重点介绍大家可能感兴趣的技术资源和即将举行的会议。 

    比起常规 ChIP 方法,Abcam ChIP 试剂盒有一些关键优势。首先,反应发生在 96 孔板中,所以很容易进行规范化操作,而且非常适合于高通量应用。您的实验只需要 5 小时。 试剂盒包含所有必要的试剂(除了交联试剂)。沉淀 DNA 可以直接用于后续分析,如 ChIP芯片或 ChIP测序等 David 刚才介绍过的技术。

    我们的全新高灵敏度 ChIP 已进行专门优化,特别适用于样品数量有限的 ChIP 分析。例如,处理患者样本、转基因小鼠组织或干细胞的情况。使用高灵敏度 ChIP 试剂盒,每次反应您只需 2000 个细胞或 0.5 毫克组织便能获得富集的目标序列。此外,仅用 5 个小时就能得到实验结果,所以实验可以在一个工作日内完成。

    我们还提供甲基化 DNA 免疫沉淀试剂盒。这些试剂盒包含高度特异性抗体,用于富集甲基化和羟甲基化 DNA。这些修饰与不同的基因表达相关,因此,需要有适当的工具来研究其功能。我们的免疫沉淀试剂盒还可以完善常规 DNA 甲基化实验,如亚硫酸氢钠修饰不能区分甲基化和羟甲基化胞嘧啶。

    最后,请记住,投入决定回报,所以成功的 ChIP 实验离不开良好的起始材料。精心设计的 Abcam 染色质提取试剂盒,可制备 ChIP 实验所需的染色质。不到 1 小时,您从细胞或组织中提取的染色质就可以用于 ChIP 实验了。

    如果你想了解更多有关不同技术和应用的信息和知识点,欢迎您随时访问我们的在线讲座资料库,观看您所需的在线讲座录像。请访问 www.abcam.com/webinars事不宜迟,这里交给 David,他将回答我们在讲座期间收到的问题。

    DG:谢谢 Ken。我现在回答一些观众在讲座过程中提出的问题。这里有个问题是:交联 ChIP 与自然 ChIP 的主要区别和优缺点是什么?一般来说,当蛋白质 - DNA 相互作用不是很强烈时,建议使用交联 ChIP,举个例子,观察与 DNA 结合的转录因子或大分子蛋白质复合物的情况。对于甲醛,建议进行交联 ChIP,因为甲醛形成的交联是可逆的。染色质经超声处理后形成长短不一的片段,每个片段含 200 - 1000 对碱基对。交联 ChIP 的主要缺点是,由于交联反应,抗体结合表位可能被遮盖,还有就是超声处理产生的染色质片段长短不一。

    当蛋白质 - DNA 相互作用较强时,建议使用自然 ChIP,比如观察组蛋白和组蛋白修饰的情况。在自然 ChIP 中,使用微球菌核酸酶分解染色质以产生单体大小的片段,大约是 175 对碱基对。这是在 ChIP 实验中可能达到的最高分辨率。自然 ChIP 也没有交联可能造成的抗原表位遮蔽。自然 ChIP 的缺点是不适用于非组蛋白,并且核小体可能在消化期间发生重排。

    另一个问题是:ChIP 实验有什么好的对照吗?在抗体对照方面,对于活性基因的阳性对照,可以使用抗组蛋白 H3 4 位赖氨酸三甲基抗体,而对于失活基因的阳性对照,可以使用抗组蛋白 H3 9 位赖氨酸三甲基抗体。一般的组蛋白抗体,如抗组蛋白 H3 抗体,也可以是一个很好的阳性对照,这也是将组蛋白修饰按照组蛋白含量进行归一化的重要方法。对于阴性对照,可以使用无抗体添加的磁珠、相应的 IgG 同型对照、或靶向非染色质靶点的抗体(如抗 GFP 抗体)。对于 PCR 对照,应该包括一个不包含 DNA 的无模板对照,以及目标蛋白应当结合位置以及目标蛋白不应结合位置的引物对照。

    现在看来,我们还可以回答一个问题,这个问题是:在 ChIP-seq 之前如何验证抗体?编码项目已经提出了指南,我刚才也谈到了抗体验证。他们认为,第一步是通过蛋白质印迹法或免疫荧光法来检测抗体。下一步他们推荐以下 4 种方法之一的抗体检测:在靶蛋白敲除细胞中验证、免疫沉淀加质谱验证、针对目标蛋白不同部位的多个抗体进行免疫沉淀、或表位标记蛋白进行免疫沉淀。之后抗体就可以用于 ChIP ChIP-seq 测试。也有在线数据库显示哪些抗体已经过完全验证可用于 ChIP-seq 

    好的,感谢 David Ken 的精彩介绍。如果您对本次在线讲座的讨论内容有任何问题,或有任何技术方面的咨询,我们的科学支持团队很高兴为您服务。您可以通过 cn.technical@abcam.com 联系他们。我们希望大家在今天的讲座中能收获到对自己有帮助的东西。我们期待您参加下一次在线讲座。


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