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蛋白质免疫印迹 (Western Blot, WB) 入门网络研讨会

观看Abcam 蛋白质免疫印迹专家讲解的在线点播研讨会

蛋白质印迹(WB),也被称为免疫印迹,用于特定抗体分析多蛋白样品中的某个蛋白。首先通过凝胶电泳区分不同大小的蛋白,然后转移到膜上,用特定抗体来检测。此技术广泛用于生物学研究,因为它能提供蛋白质分子量的信息,以及不同样品之间相对表达丰度。

蛋白质印迹(Western Blot, WB),也被称为免疫印迹,用于特定抗体分析多蛋白样品中的某个蛋白。首先通过凝胶电泳区分不同大小的蛋白,然后转移到膜上,用特定抗体来检测。此技术广泛用于生物学研究,因为它能提供蛋白质分子量的信息,以及不同样品之间相对表达丰度。

学习此网络研讨会中有关样品制备和疑难解答部分的建议。

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网络研讨会主题:

  • 样本制备
  • 电泳
  • 蛋白转膜和染色 
  • 对照
  • 疑难解答 
  • 抗体选择


关于演讲者:

Caitlin Buckspan于2007年在佛罗里达大学获得生物工程专业学士学位,2010年在加州大学圣地亚哥分校获得生物工程硕士学位。在佛罗里达大学,她研究了白蚁激素水平的季节变化,她的研究频繁使用WB技术。

Caitlin的硕士论文是关于小鼠模型中间充质干细胞随年龄的改变。她于2010年加入Abcam技术支持团队,目前为组织化学协会和干细胞研究国际协会的会员。


研讨会解说词:

女士们先生们,大家好,谢谢大家来听今天的这个讲座:蛋白质印迹原理介绍和疑难解答。今天的讲座的主持人是 Abcam 活动经理,Jaime Robinson。现在,让我们欢迎 Robinson 女士。

JR:大家好,欢迎参加 Abcam 蛋白质印迹原理介绍和疑难解答在线的讲座。今天的主讲人是 Abcam 的技术支持团队成员 Caitlin Buckspan。Caitlin 于 2007 年在美国佛罗里达大学获得生物工程理学士学位,2010 年在加州大学圣迭戈分校获得生物工程硕士学位。在佛罗里达大学时,她研究了白蚁激素水平的季节变化,该研究主要使用蛋白质印迹法。她的硕士论文使用小鼠模型重点研究随着年龄的增长,间质干细胞的相关变化。2010 年,Caitlin 加入 Abcam 技术支持团队,目前是组织化学学会和国际干细胞研究学会的成员。

还有一位主讲人是 Mandeep Sehmi,我们的核心重点领域团队成员。Mandeep 在英国阿斯顿大学获得应用与人类生物学学士学位,然后在英国莱斯特大学获得分子病理毒理学硕士学位。之后一直在莱斯特大学医学研究理事会毒理部工作,主要研究 B 细胞白血病。这期间,Mandeep 获得了 B 细胞癌症免疫学博士学位。在博士学习期间,Mandeep 致力于鉴定 B 细胞淋巴瘤中的一种新型膜蛋白,HVCN1,这种膜蛋白在正常的 B 细胞以及 B 细胞淋巴瘤的亚型功能中发挥重要作用。Mandeep 于 2011 年加入 Abcam。

如果在讲座中有任何问题,可随时通过您屏幕右方的 Q&A 面板提交问题。在讲座最后的疑难解答环节,我们将统一进行解答。现在,让我们欢迎 Caitlin,她将给我们介绍蛋白质印迹原理和问题排查。下面,在线讲座即将开始。

CB:大家好,欢迎大家参加我们的蛋白质印迹在线讲座。今天,我们将学习蛋白质印迹法的基本原理,除此之外,我还将介绍一些问题排查案列。我要提醒大家,如果您有任何疑问,可以通过电脑屏幕右侧的 Q&A 面板提交问题,讲座结束后,我将对部分问题进行解答。

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那么,什么是蛋白质印迹法?其工作原理是什么?蛋白质印迹法是一种复杂的技术,概括来说,这种方法主要用于鉴定含多种蛋白的样品中某一特定的目标蛋白。首先,采用凝胶电泳法按照分子量将蛋白质逐一分离,然后,用特异性抗体来鉴定目标蛋白。通过将结果与蛋白标准品的分子量比对,我们可得到目标蛋白的分子量,同时,我们还能测定目标蛋白在样品中的相对含量。在这张蛋白质印迹图中,可以看到目标蛋白 β-Actin的分子量在 38 kDa 附近,这是通过与已知分子量的蛋白Marker比较所得到的结果.在第二泳道中,抗体的上样量减少了,因而条带颜色比其他泳道要淡一些。

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基本上,如果您想要获得目标蛋白在样本中的表达的信息,WB就是一个有用的和常用的方法。比如这里罗列的几条。蛋白质印迹法可用于检测样品中是否有目标蛋白的表达,它也可以反映不同样品或实验组间的目标蛋白表达的差异。如果想将某一抗体用于免疫组化或免疫细胞化学,那么可以先用WB来验证抗体的特异性,这一点非常有用。因为在WB中蛋白被分离开来,所以有无交叉反应可以直接看到。

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本讲座中,我们将概括地学习蛋白质印迹法的各个步骤,同时介绍实验中应当使用何种对照品,以及如何选择合适的抗体。最后,我将介绍一些关于蛋白质印迹的常见问题以及方法优化的示例。

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蛋白质印迹分析成功的第一步在于正确制备样品,因为最终结果的质量完全取决于起始样品。

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样品制备主要包括三步:样本的裂解、定量以及还原变性。 

蛋白质裂解是利用缓冲液和机械搅拌来彻底溶解细胞或组织中的蛋白质。对细胞或组织样品而言,操作方法稍有不同,但原理基本一致。在裂解缓冲液中搅拌样品使其均质化,然后离心,收集上清液。

样品完全裂解后即可进行蛋白浓度测定。可以使用考马斯亮蓝法,也可用 BCA 测定法,具体方法可以自行选择。对于蛋白电泳而言,蛋白定量非常重要,因为需要确保各样品中的蛋白上样量均等。

样品制备的最后一步是还原和变性,这一过程中蛋白质高级结构被破坏,变成初级氨基酸结构,以便在电泳中分离开来。待测样本中需加入还原剂和去污剂,并通常会在 95 °C 加热 5 分钟。对于某些蛋白质,尤其是多次跨膜蛋白,加热温度不宜过高,因为在较高温度时这些蛋白质会发生聚集。

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对于样本裂解,有几点需要强调,这对确保蛋白质完全溶解非常重要。

首先,整个裂解的过程都需要在低温条件下完成,同时请确保是新鲜地添加蛋白酶抑制剂,这是因为细胞和组织中存在有活性的蛋白酶,它们可以降解样本。另外,如果您要检测的是磷酸化的蛋白,那么您还需要添加足够的磷酸酶抑制剂。最后,裂解缓冲液的选择取决于目标蛋白在细胞中的定位,比如 NP-40 或 RIPA 等较强的缓冲液适合用于裂解细胞膜蛋白或细胞器膜上面的蛋白。

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接下来,我们来进一步探讨蛋白样本的还原和变性。

为了使样本被还原和变性,样品缓冲液中会含有十二烷基硫酸钠 (SDS) 和β-巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT)。SDS 是一种变性剂,用来打破蛋白的高级结构,变成初级的氨基酸结构,同时以恒定的质量比包被蛋白质,使其带上负电荷。这一恒定的负电荷比是下一步凝胶电泳分离的关键。β-巯基乙醇和 DTT 都是还原剂,用来断开蛋白自身的二硫键,进一步使蛋白质变成线性结构,此图中简单地展示了这一过程。顺便提一下,有些抗体只能够识别目标蛋白的天然结构,在这种情况下,样本不需要被还原和变性。所以还原和变性的步骤可以省略。但是,大多数蛋白质印迹分析都需要在还原和变性的体系中进行。

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样品制备完成后,即可进行凝胶电泳。

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凝胶电泳是通过分子量的大小来分离蛋白质。我们实际上是在电场中分离蛋白质,并且利用不同分子量的蛋白质以不同的速率通过凝胶基质的原理。这张图中是用于凝胶电泳的典型装置。 

蛋白质印迹分析中电泳分离的步骤通常简称为 SDS-PAGE。SDS 是变性剂,被添加到电泳缓冲液中。PAGE 表示聚丙烯酰胺凝胶电泳,因为凝胶一般由聚合丙烯酰胺制成的。

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那么 SDS-PAGE 的工作原理是什么呢?我们用高交联度的丙烯酰胺做成多孔的凝胶,然后浸入一个充满缓冲液的电泳槽中。蛋白样品被加入到凝胶孔中。凝胶孔位于各泳道的顶部,也就是凝胶上的一个凹陷,蛋白样本就沉在其中等待施加电流。一旦电流接通,蛋白样本即开始向正极迁移,因为蛋白样本经过SDS处理已带上负极。分子量越小的蛋白在凝胶里面受到的阻力也越小,在凝胶中的移动就越快。当停止施加电流后,它们在凝胶中移动得更远,蛋白得以按分子量高低相互分离。 

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凝胶由聚丙烯酰胺和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)交联制得,当加入过硫酸铵和 TEMED 时,胶就开始凝固。通过改变丙烯酰胺百分比可调节凝胶的结构。基本上,通过增加丙烯酰胺的总百分比,可使凝胶的孔变得更加致密,减缓小分子蛋白的移动。因此,研究小分子蛋白时,高百分比的凝胶比较合适。反之,丙烯酰胺的百分比越低,凝胶基质的孔越大,便于大分子蛋白的迁移,在凝胶中的分离效果也越好。还有一种梯度凝胶,是由多层不同百分比的丙烯酰胺组成,可同时检测小分子和大分子蛋白。如果同一分析中需要检测多种蛋白,或者不确定目标蛋白的分子量,我建议您可以使用这种梯度凝胶。

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我们刚才说过,有时候您会不需要将目标蛋白进行还原变性。这就需要调整电泳缓冲液的成分,以及样品制备期间上样缓冲液的成分。可以参考下面这张表,您基本是只需要记住,如果需要不变性的蛋白(即天然构态的蛋白),那么上样缓冲液和电泳缓冲液中就不能含有SDS。如果需要未还原的蛋白(即氧化态的蛋白),那么上样缓冲液中就不添加 β-巯基乙醇或 DTT。

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凝胶电泳的下一步是蛋白转印。

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在电泳之后,目标蛋白需要被显现出来让您可以看到。所以蛋白质将从凝胶中转移到一个膜的表面,蛋白质印迹法中“印迹”一词就来源于转印步骤。对于用抗体检测,凝胶不是一个好的材料。因为抗体无法结合到蛋白质上,而且凝胶容易被撕裂,很难操作。因此我们需要把蛋白质转移到一个更耐损的材料上面进行免疫染色。

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那么,转印的工作原理是什么?转印的原理类似于电泳,带负电荷的蛋白会向电场中的正极进行转移。凝胶和膜放在一起,做成像三明治的样子放在专门的盒子里面,其中膜需要放在靠近正极的一边。应当避免凝胶与膜之间出现气泡,因为空气是绝缘体,不会导电,所以气泡所在范围内的蛋白无法转移。我建议用一个锥形管的长边滚压转印夹层,以除去气泡。将夹层放入转印槽,当施加电流后,蛋白质开始迁移并附着到膜上,蛋白的分布情况与其在凝胶中的保持一致。 

市面上有许多不同类型的膜,材质不同,以 PVDF 或硝酸纤维素膜最为常见,膜的孔径也千差万别。每种膜的特性都不相同,对较难转印的目标蛋白,我建议采用 PVDF 膜。但是,某些情况下,PVDF 可能造成高背景。所以,您可以尝试几种不同的膜,看看哪一种对自己的系统和样品蛋白效果最佳。转印后,我建议采用可逆型蛋白染色液,如丽春红,来染膜,以确保蛋白质从凝胶中完全转移出来了。

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常用的转印方法有两种,湿法和半干法。这两种方法的主要区别在于,湿法转印中,夹心层被浸没在注有电转缓冲液的槽中,而在半干法中,夹心层被直接置于阴极与阳极之间。半干法较快,但膜可能会干掉导致蛋白无法转印。湿法转印用时较长,但对于大分子蛋白或疏水蛋白等较难转印的蛋白,这个方法更适合。 

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对于大分子蛋白的转印,例如要转印分子量大于 100 kDa 的蛋白质,我有几个建议。首先,在低温条件下,采用低电压过夜湿法转印。同时,在电转缓冲液中添加 SDS,以防止蛋白质积聚在凝胶中。并将电转缓冲液中的甲醇浓度降到 10% 或更低,这有助于凝胶胀开来释放蛋白。如果您用的是 PVDF 膜,那么缓冲液中可以不添加甲醇。转印完大分子蛋白,您也应当在膜上使用丽春红染色,来确保蛋白已完全转印了。

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蛋白质转印到膜上以后,就可以用特异性的抗体来染色和观察了。

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那么,我们为什么要使用抗体?在凝胶中可以使用考马斯亮蓝等蛋白染料,也可以在膜上使用丽春红等蛋白染料,但这些都是非特异性染料,样品中的所有蛋白都会被染色,就像左图这样。这样很难确定是否是目标蛋白,更难比较不同样品中目标蛋白的量。因此,只有使用特异性的抗体,才能清晰地分辨出目标蛋白,得到右图这样的效果。

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免疫染色法的第一步就是用中性蛋白来封闭膜上的裸露区域。这一点非常重要,因为任何蛋白都可以贴附在膜的表面,包括抗体也会非特异性地粘到裸露的膜上。但由于抗体不会与中性蛋白结合,所以可以用TBST 配制3-5% 牛奶或 BSA 的混合溶液进行封闭,将膜完全浸没入封闭液里面。牛奶或BSA里面的中性蛋白会结合膜上的裸露区域,这样抗体就无法再粘上去了。封闭的过程中,膜被放在摇床上面,可以是4度过夜或者是室温1小时封闭。 

封闭结束后,倒掉封闭液,加入稀释后的一抗,需要覆盖到整张膜。抗体可用 TBST 或封闭液来稀释。如果您是第一次使用该抗体处理样品,建议您尝试不同的抗体稀释度,以便找到最佳的稀释倍数。然后膜被放在摇床上面,可以是4度过夜或者是室温1小时的孵育,一抗将与膜上面的目标蛋白结合。 

抗体与目标蛋白结合后,需清洗转印膜,除去残留的抗体。我建议用 TBST 洗膜,放在摇床上清洗,每次约10分钟,重复3-5 次。 

一抗处理后,再用二抗孵育膜,二抗上面的偶联分子可以使目标蛋白被显现出来。二抗会特异性地与一抗结合,其实也是结合到了目标蛋白上。二抗孵育一般是室温下约 1 小时。

然后,再次彻底清洗转印膜,除去多余的二抗。用 TBST 洗膜,放在摇床上清洗,每次约10分钟,重复3-5 次。清洗完成后,就可以通过二抗上面的偶联分子来检测目标蛋白了。 

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蛋白质印迹法中最常使用的检测方法有三种。第一种是采用化学发光底物,如 ECL 或 ECL Plus,后者更灵敏。此例中的二抗偶联了辣根过氧化物酶 HRP,HRP 催化底物反应,产生信号,该信号可以在胶片上显现出来。类似地,像氯萘酚或DAB等显色底物也可与二抗上偶联的另一种酶反应,直接在膜上显现出颜色。这种情况下,不需要使用专门的检测设备,所以如果实验室尚未配备齐全的蛋白质印迹分析设备,可以使用这种方法。最后一种方法是使用偶联了荧光染料的二抗,荧光信号可通过专业的检测系统检测。 

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每一个周密的实验,都应该有合适的对照。现在,我们来谈谈蛋白质印迹法中一些重要的对照。

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蛋白质印迹分析中,常用到一种上样量的内参对照,它是除目标蛋白抗体之外的另一种抗体。上样内参是检测样品中一种常规含有的蛋白量,这种蛋白的比例在各个样品中应该大致相同。假设电泳过程中,各样品中等量的蛋白被加载到了凝胶上,那么上样内参的条带宽度,信号强弱应该基本相同。如果上样过程出错了,那么上样内参的条带会有差异。上样内参的选择取决于您使用的样品裂解液。如果样品是全细胞裂解液,上样内参一般为 β-actin、GAPDH 或Tubulin。对于线粒体蛋白,可使用 VDCA1 或 COXIV 作为对照,而对细胞核蛋白,可以使用 Lamin B1 或 TATA 结合蛋白。

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在比较不同样品的上样内参时,需要注意到,在不同物种来源的裂解液中,同一个目标蛋白的本身表达量会有差异。在这个图例中,每条泳道都上了等量的样品,但样品来源于不同的物种,然后用beta-actin作为内参。虽然各泳道的总蛋白上样量一致,但第三泳道的鱼样本条带颜色明显要浅,这是由于鱼样品本身的beta-actin的蛋白表达量就要低于其它物种的样本。 

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除了上样内参,检测未知样品时,最好同时带上阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是确定含有目标蛋白的样品,如重组蛋白、转染细胞系或目标蛋白表达量已知的组织或细胞。阴性对照是确定不含目标蛋白的样品,比如是基因敲除或 siRNA 处理的样品,或者目标蛋白不会表达的组织或细胞。 

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另一种十分有用的对照是封闭肽,常用于免疫原是多肽的抗体,不适用于免疫原是全长蛋白的抗体。使用多肽作为对照时,需先用多肽处理抗体,让多肽与抗体的表位识别区先结合,来封闭住该抗体的特异性结合位点。然后再将预处理过的抗体加到膜上面孵育。转印膜上应该不会出现任何目标蛋白的条带,因为结合位点已被多肽封闭。如果出现明显的条带,那么必定是由该抗体的非特异性结合所导致的。图例中的第三和第四泳道都未出现条带,因为这两个泳道所用的抗体都是预先用免疫原多肽封闭过的。其他泳道中,抗体是用与免疫原比较相似的不同多肽进行预处理的,条带还是出现了,说明其它非免疫原的多肽都无法封闭抗体,显示了该抗体的特异性。 

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接下来,我们来重温一下进行蛋白质印迹分析时,如何选择合适的抗体,需要注意哪几点。

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第一点非常明显,就是选择一种已经在WB中被测试过的抗体。这一点非常重要,因为并非所有的抗体都能在蛋白质印迹分析中得到良好的结果。在我们 Abcam 的网站上,对于已经测试过且可用于蛋白质印迹分析的抗体,我们会在其应用推荐中标明 WB。因此,在寻找合适的抗体时,可以参考这一栏。如果在应用中没有列出蛋白质印迹 (WB),那么此抗体可能尚未在WB中被检测过,那么您可以联系我们的技术支持部门。技术支持团队的联系方式将在本讲座的后面部分给出。

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有时候您的研究范围不涉及目标蛋白的特定区域与抗体的结合。但当您要研究该蛋白的某一特定的同种型蛋白Isoform,或要比较该蛋白的前体与成熟的剪切体,那么就需要考虑此抗体的特异的表位了。通过抗体免疫原序列的设计,可以了解到抗体所识别的蛋白区域,因为动物产生的抗体只会针对这一特定序列的蛋白。多克隆抗体可以识别整个免疫原序列,但单克隆抗体只会识别其中某一段较短的序列。如果您要研究的蛋白是一个特定的同种型蛋白,那么请确定免疫原的范围与目标蛋白的氨基酸序列有重叠。

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现在,我们已经讨论了如何成功地进行蛋白质印迹分析。接下来,我们来谈谈当结果差强人意时,如何改进实验结果。这里举了一些例子。

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有时,您得到的蛋白质印迹分析结果可能会跟这张图一样,泳道完全是空的,或者有些预期分子量附近的条带颜色很淡。如果印迹上完全没有条带,那么也许是蛋白未能转印到膜上,这可以用丽春红染料进行核查,也可能是因为二抗无法识别一抗。当然,还有可能是样品中没有目标蛋白的表达,这种情况,可以在分析样品的同时带上阳性对照。如果是条带很弱,那么可以增加蛋白上样量和所用抗体的工作浓度。可以尝试不同的封闭液,或者缩短封闭的时间,也可以延长抗体的孵育时间。如果采用化学发光检测,那么我建议,可以延长胶片曝光时间。

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也有可能遇到高背景,或者印迹上出现多条带的问题。我建议,可以降低总的蛋白上样量,并进一步稀释抗体。还可以更换封闭液。另外,如果使用的是PVDF,可以尝试换成硝酸纤维素膜。如果是用化学发光检测,也可以缩短曝光时间。如果杂带的分子量低于目标蛋白的分子量,那么目标蛋白可能被降解。请确定裂解时,有新鲜地添加蛋白酶抑制剂到裂解缓冲液中,整个过程是在冰上面进行的。如果杂带的分子量为目标蛋白分子量的倍数时,比如,本该在 50 kDa 处出现条带,却在 100 kDa 处出现条带,则需要将样品再煮久一点,确保多聚体被破坏。当然也可以查阅文献。我推荐到 SwissProt 网站上查一下蛋白质是不是会被翻译后修饰,比如糖基化、乙酰化或磷酸化,或者蛋白质是不是有不同的同种型或剪切片段,这些都可以说明解释印迹上的额外条带。

这是我们内部测试的一个例子,有一个印迹上的背景很高,此印迹对应的一个抗体的新批次。技术人员认为可能是稀释抗体时发生了错误,抗体的工作浓度应该是 1 mg/ml,于是他们简单地用母液重新配制了工作稀释液。

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为了以防万一,他们同时还将样品裂解液稀释了 10 倍和 100 倍。新的结果表明蛋白质印迹效果很好,而这仅仅只是重新稀释了抗体和样品。

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这里有两个有趣的数据,这些抗体只在用某一种封闭液封闭膜时,WB结果会比较好。您可以看到,左边的这张图中,当用 5% BSA 封闭转印膜时,结果中出现了多个条带。但当用 5% 牛奶封闭时,结果中出现了一条清晰但是颜色很淡的条带。但这里不是说牛奶就总是理想的选择。在右图中,当用 5% 的 BSA 封闭时,抗体显示了很强的信号,而用牛奶封闭转印膜时,几乎没有检测到结果。其实许多抗体不论是在牛奶还是在 BSA里面封闭,效果都是不错的,所以如果当刚开始的结果不理想时,您可以尝试不同的封闭液。如果用磷酸化特异性抗体来分析某一蛋白时,那么就意味着抗体只检测磷酸化的蛋白。在这种情况,我建议用 BSA 作封闭液。因为牛奶本身含有磷酸酶,可切割目标蛋白的磷酸基团,使得抗体无法结合,最终结果将不会出现条带。如果明确某一抗体与某一特定封闭液连用时效果不错,我们会将这些信息添加到产品说明书中。如果想了解某一抗体更多的QC信息时,您可以随时联系我们。

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这里有一个例子,其中存在了很多的问题。大家不用担心,这个抗体没有通过质检,所以不会被销售。但是这张图中出现了很多常见的问题,所以我想在这里和大家探讨一下。首先,这张图表明,转印过程中出现了气泡。由于空气不导电,因此蛋白质并未迁移到转印膜上。避免此情况的一个简单方法是,在装载三明治夹层的时候,用一个锥形管在夹层上面进行滚压来排除气泡。除此之外,膜上的印迹表明,清洗膜不到位,膜上还有试剂的残留。为避免这个问题,需确保转印膜完全浸没入溶剂中,在孵育的过程中,还要在摇床上轻轻摇动。最后,我要指出的一点是,在右上角的这个区域,可以看出是凝胶与膜没有贴合,这可能是因为凝胶发生折皱或被撕裂。如果膜上的凝胶不平整,还是可以用锥形管在夹层上滚压,确保所有区域完全贴合。如果凝胶经常撕裂,那么可以尝试种不同类型的凝胶,比如我们的新产品Optiblot 凝胶,这类凝胶的强度可达到传统凝胶的十倍。从这个例子中,我们可以看到,在蛋白质印迹分析中,会出现各种各样的问题,但是这些都是可以解决的。转膜后,用丽春红对转印膜进行染色是个好习惯,因为这样可以尽早发现问题,如有必要,可以重新进行电泳和转印。

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这里还有一个不完全转印的例子,但此例中,仅大分子蛋白在转印时出现问题。这里可以看到,至少有一个大分子蛋白标准品,但均未完全转印。如果出现这样的结果,那么只需按照我们前面提到的关于大分子蛋白转印的建议,比如低电压隔夜湿法转印,降低转印缓冲液中的甲醇量等。如果出现相反的问题,意味着膜上只有大分子蛋白,这可能是转印过度,使得小分子蛋白直接通过转印膜,因此需要缩短转印时间或降低电压。

最后,在这个例子中,抗体对非还原、非变性的蛋白的亲和力远比其他情况高。也就是说,上样缓冲液中不用添加 SDS,或 PAGE 工作凝胶中不用添加 β-巯基乙醇或 DTT。这张图是一位外部研究人员提供的,是一个非常好的抗体示例。这位研究人员发现,当蛋白被还原和变性时,胶原 III 抗体产生一条暗淡的条带,如左边的泳道所示。当蛋白未被还原和变性时,可以看到较强的条带,如右边的泳道所示。该条带位于 300 kDa 附近,反映的是一种由两个 α 链组成的二聚体,在还原变性条件下,这两个 α 链会单独在 130 kDa 附近出现条带。原始态蛋白有三维形状,沿着蛋白的 3D 外形,抗体可能有一个强结合位点,一旦该蛋白被还原和变性,此位点即消失。 

最后,我想再强调一下目标蛋白的生化特性的重要性,因为蛋白质印迹分析跟这一特性息息相关。并不是所有结果都会在预期的分子量处出现条带,导致这一结果的有很多因素。或许存在翻译后修饰或蛋白质断裂问题,造成分析的蛋白大小不均,或者样品中表达的是该蛋白的某一特定异构体。如果不确定,可查阅 SwissProt 网站或可能的一切文献,找到更多与目标蛋白相关的信息。如果在这方面或蛋白质印迹分析的其他方面需要帮助,可随时联系 Abcam 科学支持团队。我们科学支持团队的联系方式将在本讲座的后面部分给出。 

接下来,将由 Mandeep 主持讲座,她将介绍在蛋白质印迹分析方面,目前 Abcam 可提供的研究工具。本在线讲座结束后,大家可在我们的网站上下载本讲座的相关资料。Mandeep 介绍结束后,我将统一回答大家提交的部分问题,如果您还没有提交,那么可继续提交问题。

MS:谢谢 Caitlin。正如 Caitlin 提到的,接下来我要介绍在蛋白质印迹分析方面,Abcam 目前拥有的产品。在此之前,我想提醒下大家,如果有问题要问 Caitlin,可在此期间继续提交您的问题。除了良好表征的一抗和二抗,我们的产品中还有一些可用于蛋白质印迹分析,包括各种试剂和 MitoSciences 系列产品。首先,我要介绍一下我们的试剂。这些试剂包括蛋白质印迹分析核心系列 OptiblotPrism 蛋白条带标记物EasyLink 共轭试剂盒、对照品、裂解物以及 ECL 试剂盒。Caitlin 刚才有提到过,在线讲座结束后,可以下载一个 PDF 幻灯片文件,大家回头可以参考这些链接。

我们的 Optiblot 产品系列包括凝胶、缓冲液和辅助试剂,这些产品主要用于改善蛋白质印迹分析结果,改进市面上现有的产品。Optiblot 系列预制凝胶保质期长达一年,同时还带有强化凝胶功能的其他优势,比如易于显示、强度增加和使用方便的微孔。除了预制凝胶,我们还提供为优化凝胶使用专门设计的缓冲液,这种缓冲液可以购买,也可以通过我们的网站获取缓冲液配方,自己在实验室制备。我们的 Optiblot 系列还包括 Optiblot Blue 等辅助试剂,可在 15 分钟内进行蛋白质染色;还有 Optiblot Bradford 试剂,使用这种试剂能够进行可兼容清洁剂的蛋白质定量。当然,我们也提供试剂包,包括实验所需的全部凝胶和缓冲液,让您轻松进行实验。大家可访问幻灯片中的链接,了解 Optiblot 系列产品的其他信息。 

我们的试剂系列还包括预染色 Prism 蛋白条带标记物,可用于估计蛋白质大小和测定蛋白质印迹转印效率。利用彩色荧光条带,可轻松地估计蛋白大小,覆盖范围广,可用于多种分子量蛋白的检测。如果想用一抗进行快速检测,可以使用我们的 EasyLink 共轭试剂盒,使用该试剂盒可在 20 分钟内将 HRP 或碱性磷酸酶等标记偶合到一抗上。除了蛋白质印迹分析辅助试剂,我们还有上样对照,确保可将等量的裂解物添加到凝胶上。同时还有可用作阳性对照的裂解物和用于灵敏检测的 ECL 试剂盒。大家可访问幻灯片中的链接,进一步了解这些产品系列。

如果是从事代谢或线粒体研究,我们推荐 MitoSciences 系列产品,让您可以全面选择单抗、裂解物和试剂盒,优化您的研究。MitoSciences 单抗经过高度优化和验证,可用于检测不同物种的蛋白,包括人、果蝇、猴、奶牛、鼠类和酵母蛋白的检测。我们还有从特定组织中分离的线粒体裂解物,可用作蛋白质印迹分析的阳性对照。如果想自己分离某一线粒体或胞浆蛋白,我们可提供一系列细胞组分分离工具。

我们非常受欢迎的蛋白质印迹分析抗体混合物是经过优化的抗体预混液,适用于关键蛋白组合、对照酶或其他蛋白的印迹分析。这些混合物的优势在于,一条泳道中可检出多种蛋白,因此可通过一个蛋白质印迹分析多个样品,如图所示。

MitoSciences 免疫捕获抗体和试剂盒可用于从少量的组织或细胞样本中分离大的完整活性态酶络合物。就试剂盒而言,免疫捕获抗体不可逆地与蛋白 G-琼脂糖珠交联,促进亚基成分分析中酶的纯化,以及翻译后修饰。根据客户的应用需求,免疫捕获抗体可单独提供。图中是有关这方面的一个实例,可以看到,OXPHOS 通路中的 ATP 合成酶已使用免疫捕获试剂盒 ab109715 进行免疫沉淀。蛋白条带的一致性已通过质谱确认。

如果是从事干细胞研究,我们有一系列全面测试过的抗体,适用于胚胎干细胞,包括 Oct4、Sox2 和 Nanog。在生殖细胞研究方面,我们可提供 DDX4、DAZL、Stella、GCNF 和 PIWIL2 等产品。就癌症研究而言,这些是我们推荐的一些合适的抗体。如果是从事癌症代谢研究,那我们的 mTOR、TGF-β 和 VEGF 等产品将会非常适合。在组织缺氧方面,我们推荐 Hsp90 和 HIF1α 蛋白抗体。大家可访问我们的网站,查找更多蛋白质印迹测试过的抗体,用于干细胞、癌症研究和其他研究领域。 

Abcam 产品目录中有 2500 多种二抗。就蛋白质印迹分析而言,二抗主要偶合 HRP 和碱性磷酸酶等酶。我们也有一些抗体可在荧光扫描仪上检测。二抗与内源性免疫球蛋白的交叉反应是一个需要考虑的问题,特别是样品组织中免疫球蛋白含量丰富时。为解决此问题,推荐使用我们的预吸附抗体,这些抗体可预先吸附多达三种或八种蛋白。如果需要特异性二抗,可以尝试我们的 Fc-特异性抗体系列。与一般的二抗不同的是,Fc 二抗仅结合一抗的重链,不会同时识别重链和轻链。例如,羊抗小鼠 IgG H&L 抗体可潜在结合 IgG 以外的其他小鼠免疫球蛋白的轻链。当使用羊抗小鼠 IgG Fc 二抗时,不会存在结合其他轻链的风险。 

当使用对重链和轻链均有特异性的抗体进行免疫沉淀样品的蛋白印迹检测时,可发生/出现两个条带,50 kDa 附近的重链和 25 kDa 附近的轻链。倘若已进行免疫沉淀的目标蛋白的条带位于 50 kDa 附近,则重链会妨碍目标条带的检测。为解决这一问题,只需采用我们的轻链特异性二抗系列产品,这些二抗不会识别重链。 

在这里,我要提醒一下,关于本研讨会中提到的产品,大家可以通过幻灯片以及 PDF 副本中的链接查找其他相关信息,研讨会结束后即可进行下载。如想了解更多提示和技巧,可参见蛋白质印迹分析方案、指南和常见问题解答,也可通过给出的链接访问我们 Abcam 的网站,查询 Optiblot 系列产品。

如有疑问,Abcam 科学支持团队很高兴为您服务。我们可提供多种语言的技术支持,包括英语、中文、日语、西班牙语、德语和法语。

如想了解更多促销信息和购买,请访问幻灯片中给出的链接。谢谢各位的支持。接下来,让我们欢迎 Caitlin,她将回答各位提交的部分问题。

CB:谢谢大家踊跃提问。时间允许的话,我会尽量回答更多问题。首先,很多人对于大小和目标蛋白一样的蛋白上样对照存在疑问。在使用上样对照时,有几种不同的物质可供选择。首先,β-肌动蛋白是比较常用的上样对照之一,其分子量约为 38 kDa。但如果目标蛋白的分子量约为 38 kDa,而仍想使用 β-肌动蛋白做上样对照,那么可以先用 β-肌动蛋白抗体来标记,然后从转印膜中剥离该抗体后,再使用其他抗体。这个方法是可行的。我们网站上确实有一个剥离与再标记方案,具体可参见 Abcam 网站的科学支持版块,里面就有这样一个方案。我的建议是,仅使用与目标蛋白分子量不同的上样对照。 

对任何一种蛋白或您现有的任何一种样品,都有几个不同的上样对照可供选择,所以,使用不同分子量的上样对照会比较容易。这样做的好处在于,如果上样对照的分子量与目标蛋白明显不同,那么在转印后,您可以切割膜,然后用两种完全分离的不同抗体染色。如此,就不必进行多余的剥膜和重新标记步骤。每剥一次膜,都可能损失一些膜里的蛋白,如果试图定量或者仅定性不同样品间的目标蛋白量,这个步骤也会影响到最终结果。因此我建议,使用一种与目标蛋白分子量不相近的上样对照。

有位名叫 Azada 的用户问了梯度凝胶的问题,谢谢你,Azada。Azada 问:“对于梯度凝胶的制备,你们有具体的方案吗?如果有,这些方案可以买得到吗?”我建议,可以直接买方案。当然,也可以自己制定方案,但直接购买会容易得多,有不同百分比的丙烯酰胺方案可供选择。常见的一般是 4%–20%,利用此范围的方案,可以分析很多大小不同的蛋白。因此我建议仅购买丙烯酰胺为 4%–20% 规格的梯度凝胶。

有位叫 Dev 的用户问,一抗一般持续多久有效?Dev 用过一种储存了五年的抗体,结果没有看到任何信号,那么抗体是否已经降解?答案是肯定的。五年时间的话,只有在零下 20 °C 储存时,抗体才可能存活,但抗体一定会降解。所以我建议,虽然抗体在储存前效果很好,还是请使用新抗体,旧抗体很可能在储存过程中已经损坏。

有位叫 Luke 的希望得到更多有关磷酸化蛋白的建议,希望重复一下检测磷酸化蛋白所需的事项。那么,第一步,在制备样品过程中,请务必加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂,如果之前不是这么做的话。第二步,我们说过,是用 BSA 进行封闭,可以用 3%-5% 的 BSA 代替牛奶作为封闭缓冲液。因为牛奶本身含有可以断开磷蛋白的酶,如果使用牛奶,抗体就无法结合磷蛋白。

有位叫 Balaji 的问,有没有磷酸化抗体的封闭多肽?这个是有的。一般来说,大多数磷酸化特异性抗体都会有一个封闭多肽。如果是一个检测蛋白上特异性磷酸化残基的抗体,那么其免疫原就必须是那个特异性区域。如果买不到的话,可以自己制备一个多肽,但是要知道,必须制备一个对应此区域的多肽,并在该特异性残基上进行磷酸化。

来看下一个问题,Moosu 说:“我自己转的膜有时会在条带附近出现斑点,我已经延长了清洗时间,并且丽春红染料检查表明,膜中没有气泡”。我猜测,这些斑点也许只是一种透膜的斑驳外观,有时候你见到的斑点是因为 BSA 封闭液或牛奶粉未在 TBST 溶液里完全溶解,最后在膜上留下一些斑块或斑点。也有可能是某种溶液受到污染,然后出现斑点或斑块。所以,如果你认为存在污染,那么可以将溶液无菌过滤,或者配制新的溶液。如果觉得牛奶或 BSA 粉末难以完全溶于 TBST,那么也可以先加入粉末,再过滤封闭液,这样就可以除去可能形成的任何斑块。事实上,这些斑块本身不会影响转印,所以用丽春红染料检查时没有发现异常。但是,溶液中确实有这些斑块,所以最后会看到。

来看下一个问题,Mehmet 说:“我没有均质器,但有一个超声波破碎仪,能用来裂解组织吗?”当然可以使用超声波破碎仪,效果会很不错。但是有一点需要注意,在使用超声波破碎仪时,溶液可能变得很热,所以每次超声时间不能太长。可以超声 15-30 秒,然后在超声粉碎间隙将溶液冷却,但是,在超声粉碎过程中,样品容器周围仍然需要加冰。尤其注意,必须保证样品不变热,高温可破坏蛋白质,导致高本底。

来看下一个问题,Kent 说:“我常常看到预吸附二抗,这是什么意思?做蛋白质印迹分析要用到吗?”一般来说,预吸附是针对某些二抗进行的一种额外预处理,某些分子可能跟目标物种以外的其他物种蛋白发生交叉反应,预吸附过程可除去这些分子。比如预吸附的抗小鼠二抗,这种二抗就是预处理过的,已经去除了任何抗大鼠分子或抗家兔分子,因此这是专门抗小鼠的二抗。蛋白质印迹分析中可以不用这种二抗,在免疫沉淀后的蛋白质印迹分析中,预吸附二抗非常重要,而一般的蛋白质印迹分析使用非预吸附的二抗就行。

来看下一个问题,Ling 说:“我们实验室有人做了蛋白质印迹分析,印迹是黑色的,条带是白色的,这个问题可以解决吗?”答案是肯定的。黑色印迹上的白色条带叫逆向显带,如果是采用化学发光检测的话,那通常是因为抗体用得太多,转印膜有点被急冷和过度曝光。只需进一步稀释一抗和二抗直至该印迹显示正常,且在白色背景上看到黑色条带,这样问题就解决了。

JR:谢谢 Caitlin 和 Mandeep。我们今天的在线讲座到此结束。如果您的问题没有得到解答,我们的科学支持人员会在 48 小时内回复,到时可获得相关信息,助力您的研究。现在,我想放几张我们最近将组织的讲座幻灯片。四月份我们将有个组织干细胞讲座,六月份我们会在英国爱丁堡开展组织干细胞来源讲座,以及我们下次的在线讲座。希望这次讲座对大家有用,也希望各位可以参加我们后面的讲座。我们前面说过,如果您对蛋白质印迹分析存在疑问,或咨询其他技术问题,我们的科学支持团队很高兴为您服务,请发送邮件至 cn.technical@abcam.com。如果您有关于在线讲座或活动的任何问题,请发邮件至 cn.marketing@abcam.com 联系 Abcam 活动团队。谢谢大家参加我们的在线讲座,谢谢 Mandeep、Caitlin。感谢大家的支持,希望在未来再见到各位。非常感谢,保重!


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