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流式细胞术简介和疑难解答在线研讨会

了解流式细胞术在各种实验中如何应用,例如细胞分型,凋亡或细胞周期分析。

流式细胞术是一项强大的技术,可以对单个细胞进行多参数的快速定量测定。使用鞘液可以使细胞排成一列通过光电感应器,以检测其物理及生物学特性。

此在线研讨会将揭示多参数流式细胞术如何对复杂组分中的多个细胞群落进行精确界定。

流式细胞术是一项强大的技术,可以对单个细胞进行多参数的快速定量测定。使用鞘液可以使细胞排成一列通过光电感应器,以检测其物理及生物学特性。

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研讨会主题:

  • 样品处理
  • 抗体、荧光基团选择
  • 对照


关于演讲者:

Dr. Ina Schulte目前是Abcam技术支持团队成员。她拥有德国耶拿大学生化与分子生物学硕士学位,及德国杜伊斯堡-埃森大学博士学位。

在加入Abcam之前,Ina在剑桥大学攻读博后。她的流式细胞术经验包括细胞表面染色,以及胞内细胞因子染色,还有这两种技术的疑难解答。

我们实验室都喜欢听Ina的讲课,特别是染色技术的疑难解答部分。”

匿名听众


研讨会解说词:

大家好。欢迎参加 Abcam 的“流式细胞术”在线讲座。今天的主讲人是 Abcam 的科学支持团队成员 Ina Schulte 博士。Ina 在德国耶拿市弗里德里希·席勒大学取得了生物化学和分子生物学硕士学位,在杜伊斯堡-埃森大学取得了博士学位。加入 Abcam 前,Ina 在剑桥大学博士后研究站从事科学研究。Ina 的流式细胞术研究经验包括细胞表面染色和细胞内细胞因子染色以及这两种技术的常见问题排除。​

今天与 Ina 一起进行讨论的还有我们新产品团队的 Augustine Mzumara。Augustine 在伦敦帝国理工学院取得了人类分子遗传学硕士学位。加入 Abcam 之前,Augustine 在葛兰素史克公司担任研究科学家,分子生物学背景渊博。提醒一下,如果在讲座期间有任何问题,可随时通过您屏幕右方的问答面板提交问题。您提交的问题会在本次讲座的疑难解答环节进行答复。现在,就有请 Ina 开始本次流式细胞术在线讲座。

IS:谢谢,Lucy。

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大家好,欢迎参加Abcam的流式细胞术在线讲座。希望没有给您带来不便。接下来一个小时左右的时间我们会向您介绍这项激动人心的技术。首先,我将大致介绍流式细胞仪的使用方法,包括基本实验方案。然后,我会简要地针对展示的数据给出科学解释,最后再谈谈结果分析和常见问题排除方案。

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有些人可能不是很了解流式细胞术,它是什么呢?流式细胞术是一种研究异质细胞群中单个细胞或生物学颗粒的强大技术。它能让我们快速地同时测量多个参数。而且,细胞还能通过细胞分选术进行分选。流式细胞术的这一分支学科通常被称作荧光激活细胞分选术 (FACS)。由于流式细胞术的多功能特性,其广泛应用于基础研究和临床研究。

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流式细胞术应用的研究领域包括:特定细胞表面标记物的研究、细胞内标记物或荧光蛋白质的研究。还可用于分析细胞的 DNA 含量,还有很多很多其他用途,可以参见如下列表。流式细胞术起初是用于分析白血病患者的血细胞,现在仍然用于分析多种实验环境下的免疫系统的细胞表型,如疫苗研究。流式细胞术还能用于表征实体瘤癌细胞和可能在体内循环的肿瘤细胞。用于流式细胞术分析的细胞,可以非常小,例如细菌,也可以非常大,甚至是整个有机体。令人惊讶的是,流式细胞仪能用于研究秀丽隐杆线虫的某些突变。在这些研究中,整个线虫通过流式细胞仪,进而检测靶标的表达。

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因为流式细胞技术的强大功能,使其应用频率与日俱增。图表显示了过去 35 年中提到流式细胞术或 FACS 的出版物数量,我们可以看到数量在稳步增加。

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但是怎么应用流式细胞术呢?流式细胞术的流程分为三步:(A) 制备合适的样品;(B) 仪器设置, (C) 数据分析。今天,我会指出每一个步骤的重点。

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这就是说,我会谈谈样品制备和染色方案。

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我也会讲下怎么设置仪器,包括补偿过程、所需对照,

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然后我将简单提一提数据分析和展示。

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对于流式细胞术,必须要制备单细胞悬液,这是因为样品中所谓的双联体、细胞团或死细胞会产生误导数据。如果你在分析血液样品,这基本上已经是单细胞悬液了,应将血液收集在支持当前实验环境的收集管中。对于免疫分型,推荐使用 EDTA 或柠檬酸盐作为抗凝剂的收集管。这里,我建议与收集管制造商联系,进一步了解详情。您也可能要考虑红细胞裂解。如果分析培养的细胞或组织样品,可以使用酶法或组织匀浆器来制备单细胞悬液。一般来说,利用 50 µm 尼龙网过滤所有样品很有用。此外,为了减少死细胞引起的非特异性信号或染色,要确保细胞活力。 

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下一步是细胞或生物学颗粒的染色。对于大多数实验,有直接和间接染色方案以及细胞内蛋白染色方案。

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我先讲讲直接染色方案。

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正如刚刚提到的,为确保细胞活力,建议在制备和染色步骤中将细胞放在冰上。一般一份样品含有 105 至 106 个细胞,通常以 100 µl 的体积悬浮在试管或圆底板中。根据样品制备步骤,通常使用含 BSA 或血清的 PBS 等缓冲液来清洗细胞。然后,离心细胞,去除上清液。

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下一步是封闭。像其他许多实验方案一样,向细胞板中加入含有 1-10% 的血清或者BSA的缓冲液。为了提高封闭效果,可以直接用封闭液稀释一抗,在很多情况下这就足够了。这个步骤之后同样要进行细胞清洗和离心。

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第三步是将细胞与一抗一起孵育。通过滴定实验确定抗体的最佳浓度。这样做的目的在于最大化特异性信号和背景染色之间的对比度。在直接染色方案中,一抗直接偶联了荧光染料。最常用的荧光染料是FITC 和藻红蛋白 (PE);但我们可以看到,这里还有很多染料可供选择。一般来说,样品要在 4 °C 孵育 15-45 分钟,还有,为防止荧光染料发生光漂白,需在暗处孵育。这个步骤之后同样要进行细胞清洗和离心。

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接下来,固定是可选步骤,因为细胞固定有很多利弊。一个好处是防止感染,例如,提供血液样本的患者患有传染病。固定也会带来很多便利,例如,固定的样品不需要在染色后立即分析,可以在冰箱中存放一段时间。但固定细胞的缺点是不能排除死细胞,因为固定过程基本上杀死了所有细胞。固定也会改变光散射特性,可能会增加自发荧光,所以可能需要调整仪器设置。如果您决定要固定细胞,可以使用酒精如乙醇或甲醇。这些试剂适用于大多数蛋白质抗原,当然也可以作为 DNA 检测的固定剂。您也可以选择用福尔马林或多聚甲醛进行固定,虽然是交联固定剂,但通常对大多数抗原都起作用。

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最后,在流式细胞仪上跑样前,用至少 250 µl 缓冲液将细胞重悬,这取决于所进行的测定类型或设备的要求。为了避免荧光淬灭,要将染色后的细胞保存在 4°C 的暗处,并尽快进行分析。而且,请在开始跑样前立即涡旋样品,确保得到均匀混合的单细胞悬液。

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这就是关于流式细胞术直接染色方案的内容;现在我想向你们简要介绍一下间接染色方案。

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方案的开始步骤和直接染色方案一样,首先制备单细胞悬液,然后封闭。第三步也是与一抗一起孵育。与直接染色方案不同的是,这里的一抗不带荧光标记。但可以偶联生物素,如图所示。

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洗涤步骤之后,将细胞与二抗一起孵育。二抗偶联了 FITC、PE 等荧光染料。如果使用的是生物素偶联一抗,那么需要与荧光染料偶联的亲和素或链霉亲和素进行孵育。接下来的步骤和之前一样了:清洗后是可选的固定步骤,随后在流式细胞仪上跑样。

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与直接和间接染色方案不同的是细胞内染色。

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为了让抗体能进入细胞内并识别细胞内蛋白,需进行固定和透化。要做到这点,可以使用皂素或洋地黄皂苷等膜增溶剂。这些透化是可逆的,所以可以加入到稀释缓冲液中,用于维持细胞的透化。也可以选择 Triton 或 Tween 等洗涤剂,他们能够产生不可逆的透化。如果要同时分析细胞表面标记物和细胞内靶标,我们建议在固定和透化步骤之前进行细胞表面蛋白染色。进行这一步时,请记住光散射特性可能会有大幅改变,所以可能需要相应地调整仪器设置。 

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我们现在已经制备好了宝贵的样品——接下来做什么?下一步是设置流式细胞仪。如果您不熟悉这项技术,要知道流式细胞仪不是即用型仪器。实际上是样品的类型决定了使用哪种设置。这一步骤非常重要,因为我们不希望因为设置有误而浪费了宝贵的样品。这些设置有哪些?流式细胞仪提供哪些测量或参数呢?

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一般来说,会检测两类属性:第一种,结构属性。包括细胞大小、细胞质粒度或复杂度,这是我们通常要知道的。测定这些属性不需要试剂或探针。另一种可测量的特性是与细胞功能相关的特性。这些特性包括细胞表面标记物或细胞内标记物的表达、周期性钙流。还可用于测定细胞的 RNA 或 DNA 含量。测量这些特性需要试剂或探针,这也是我们要用荧光标记抗体对样品染色的原因。这些特性到底是如何测定的?流式细胞仪的实际工作原理是怎样的?

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流式细胞仪的一大好处是一次分析一个细胞。“流式细胞仪”顾名思义,有名为鞘液流的恒定流体。将样品注入该流体中,在这个例子中,是从顶部加入。

借助流体动力聚焦过程,以确保细胞单列通过流通池,如下图所示。每个细胞依次进入激光束,激光束来自侧面,产生两种信号。一种是从染色细胞发出的荧光信号;它被传送到荧光检测器。另一种信号是所有细胞发出的前向散射光和侧向散射光。该信号被传送到光散射检测器。这些不同信号会给我们传递哪些信息呢?

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首先是前向散射光和侧向散射光。刚刚提到过,随着细胞进入激光束,光向不同方向散射,可以在这个示意图上看到,激光束从底部碰撞细胞,随之发生光散射。可收集和测量这些散射光,用于分析细胞特征。更确切地说,前向散射光与细胞大小相关;侧向散射光与细胞质粒度或复杂度相关。要确保收集正确的信号,请记住,样品类型决定了流式细胞仪使用的设置。以上是理论知识,在实际样品中是怎样的呢

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根据前向散射光和侧向散射光读数获得细胞物理特性或结构特性。利用这些信息,可根据不同的大小和复杂度特征将细胞群相互区分开来。这些结果一般以散点图表示,例如这个人类血液样品的散点图。X 轴通常是前向散射,代表细胞大小。Y 轴通常是与细胞复杂度相关的侧向散射。单个点代表一个事件。

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在这个例子中,这些细胞聚集成三个不同的细胞群。由粒度小的较小细胞组成的细胞群在左下角用绿色表示,大小相似的两个细胞群分别用红色和蓝色表示。与红色细胞群相比,蓝色细胞群中的细胞似乎具有更高的细胞内复杂度。详细分析显示,这三个细胞群代表了不同的血细胞类型。

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绿色细胞群是较小的淋巴细胞,而红色细胞群和蓝色细胞群分别是单核细胞和嗜中性粒细胞。这有助于将各个细胞群区分开来,但分析大小和复杂度都相似的细胞时该怎么做呢?所以,如果您对细胞培养的亚群中某个蛋白的表达感兴趣,那么就用荧光染料将细胞染色。这就提出了一个问题:什么是荧光? 

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荧光是荧光染料吸收不同的光(确切地说,是波长更短的光)而发出的光。光有不同的波长,如图所示,400nm的蓝光相对700nm的红光有较短的波长。每次看到彩虹,我们就能观察到这些不同波长的光。

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实验中所用的每种荧光染料都有独特的吸收光谱和发射光谱。关于每种荧光染料,首先要知道的是激发波长。这是荧光染料获取能量,被激发的特征波长。第二是发射波长,这是荧光染料释放能量发射光子的特征波长。在藻红蛋白的例子中,分子被 488 nm 的蓝色激光器激发,如这里的白色线所示。它接近由虚线表示的一个激发峰值,实线显示了 PE 在 578 nm 波长处发射的光,参见这条实线的波峰。 

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正如之前所说的,有大量的荧光染料可供选择。一般来说,可分为合成有机染料和荧光蛋白染料两大类,合成有机染料有 FITC、DyLight 系列、Cy 染料、Alexa Fluor系列等,荧光蛋白染料有 PE、APC、GFP如何在同一个流式细胞仪中检测所有这些荧光信号?这里我不得不稍微深入地讲讲流式细胞仪的技术细节。

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这是标准四色流式细胞仪的设置。如果您记得,刚刚我给大家展示了流通池和液流系统,样品在左下角这里通过所述流通池和液流系统,激光束从这的侧面发出。这里产生的散射光信号和荧光信号根据不同的波长被分开,通过一系列不同的分光镜和滤光片进入到不同的检测通道(即光学部件)。然后,单个荧光被光电倍增管(PMT)收集,大多数情况下,再依次转换为数字信号。然后在电脑上通过数据采集后分析软件进行数据分析。然而,如果您使用过流式细胞仪,就知道远不止这些。

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之前提到过,样品类型决定流式细胞仪的设置。如果使用的荧光不止一种,更是如此。在对两种荧光染料的数据进行分析时,需要对这两种荧光染料的发射光谱重叠部分进行补偿,这个过程称为补偿。

让我用最常用的荧光染料 FITC 和 PE来释这个过程。这张图非常详细,我会一一给大家讲解。现在让我们观察这条实线,这是发射光谱曲线。我们可以看到,FITC 在 520 nm 时达到最大发射峰,但是一直到 650 nm 波长处都有发射光,正如尾巴这里显示的。相反地,我们看到 PE 的最大发射峰在 578 nm,就是这里的波峰。

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如果在 550 到 620 nm 之间检测 PE 信号,这个范围是在 PE 的最大发射峰附近。在这个波长范围内,我们不仅会检测到 PE 信号,还会检测到 PE以外的信号。因此,需要通过减去所谓的“荧光泄漏”的荧光信号进行补偿,这个例子中的荧光信号就是 FITC 的信号,它泄露到了错误的检测器中,即 PE 检测器。由于有大量不同的流式细胞仪,我们在这里不能覆盖所有仪器的全部细节,希望各位查阅制造商的说明书了解详情。

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为了完成补偿,以及合理地设置仪器,需要有一系列对照。例如,使用未染色对照或阴性对照来确定背景染色或自发荧光,进而设置仪器。需要使用单染对照进行补偿。就像其他应用一样,使用同型对照、不含一抗的对照和阳性对照来确认特异性结合,排除所用抗体的非特异性结合。您可以从我们的网站及其他相关资源获得更多关于所需对照的信息。

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所以,要正确地制备样品和设置流式细胞仪,最后一步,数据分析就很容易了!

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现在市面上有各种各样的数据采集后分析软件,可以用多种方式呈现数据。最常见的是,以散点图表示流式细胞仪数据。还有伪彩图,等高线图等。如下面例子所示。

这里,我们可以看到人血液 CD4阳性 和 CD8阳性的T细胞染色结果,使用了 ab86886 和 ab86891 抗体。在这个例子中,X 轴表示 FITC 的荧光强度,表示CD4阳性的T细胞。Y 轴表示 PE 的强度,表示CD8阳性的T细胞。

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在这个图中,有四种或多或少的明显不同的细胞群,在左下方的细胞群几乎没有绿色或红色荧光,这些是 CD4 和 CD8 阴性细胞。

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沿着 X 轴的细胞群表现出不断增强的绿色荧光,但没有红色荧光;这些是CD4阳性的T 细胞。

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相应地,沿着 Y 轴的细胞群表现出不断增强的红色荧光,但没有绿色荧光;这些是CD8阳性的T 细胞。

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最后,还有一小群细胞,同时表现出红色和绿色荧光,这些是CD4和CD8都阳性的细胞。

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流式细胞仪数据也可用直方图显示,就像这个例子。对于直方图的荧光强度,举个例子,如图所示,X轴代表FITC荧光强度,Y轴代表细胞数量,从而绘制出这种类似曲线的结构。这种图主要用于细胞周期分析。

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通常通过测定DNA含量进行细胞周期的分析,直方图展示细胞中的 DNA 含量,确定细胞是单倍体还是二倍体。这种检测能够提供有关细胞毒性药物作用的信息,还能用于表征癌细胞等非整倍体细胞。 

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如果您对某类特定的细胞群感兴趣,想对其进行再培养,或将其用于后续的 PCA 或微阵列分析,需要对细胞进行分选。细胞分选该如何操作呢?与分析实验流式细胞仪的主要区别,我前面已经解释过,就是单独的细胞或生物学颗粒在通过激光束之后被包裹在鞘液滴中。那么,同样地,从顶部流下的样品进入激光束后变成单独的液滴。这些液滴将会带电,然后偏转板吸附或排斥液滴,将其分选到下面的适当收集管中。现在,大多数细胞分选仪可以同时分选四种细胞群,这种分选比磁珠更具特异性。简言之,细胞分选的关键信息就是,分析仪上观察得到的细胞,都能通过分选仪进行分选。 

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到目前为止一切都好,但如果结果不令人满意的话我们该怎么办呢?一般来说,结果不好分两种,没有信号,或者高背景染色。

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没有信号建议从如下方面考虑:实验方案需要优化、抗体质量不好、样品中靶标蛋白不表达或者表达丰度低。遇到这类问题,请检查抗体是否特异性针对您要检测的靶标蛋白。您也可以再次对抗体进行滴定实验,因为可能需要增加浓度。我们还推荐使用其他技术来确认靶标是否存在。

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高背景染色的问题可以通过降低抗体浓度来解决,也可以用血清或者BSA封闭抗体的非特异性结合。为了确定这个问题,同型对照或不含一抗的对照就很有用了。

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我希望通过今天的讲座各位了解到了流式细胞术的强大功能,并随着新荧光染料及新型流式细胞仪的出现,它还会快速发展。如果您希望了解更多信息,建议咨询您当地的流式细胞术组织或者类似的区域性组织、全国性组织,还可以通过 Abcam网站获取更多信息,如果您愿意,还可通过书籍和期刊,获取关于实验方案的详细信息。非常感谢各位的关注,也感谢各位提交的问题。如果还有任何问题,可随时通过您屏幕右方的问答面板提交问题。我稍后会回答这些问题,现在先把话筒交给 Augustine。

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AM:谢谢,Ina。大家好,我叫 Augustine,是 Abcam 的产品经理。我将简要地给各位介绍 Abcam 提供的用于流式细胞术实验的一些产品。在介绍这些产品之前,我想提一下,在演示幻灯片的底部各位可以看到我们的网站资源链接,通过该链接可获得更多产品信息。

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我想介绍的第一款产品是我们的多色 B 细胞T 细胞标记物抗体套装。

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套装包含直接偶联了荧光素的单克隆抗体。他们适用于多种仪器,对于多重染色分析非常有用。这些产品的妙处在于,如果您刚刚接触流式细胞术,那么它们是方便有效的入门试剂盒,因为抗体针对流式细胞仪已进行过优化,一个美观、整洁又方便的包装盒里有您需要的一切。

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如果您没有直接标记的一抗,或者觉得用偶联试剂盒不划算,我们也推荐使用 Abcam 二抗。

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Abcam 的产品目录中有超过 2,500 种二抗。对于流式细胞术,我们推荐预吸附系列二抗,如果您用的是 Fc 受体丰富的样品,我们还提供各种 F(ab')2 片段的二抗。 

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Abcam 的产品还有各种小分子或生物染料,包括 DRAQ5、Cytrak Orange 和 DRAQ7。

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DRAQ5 是可用于细胞周期分析的远红外荧光染料,Ina 刚刚也提到了。这种染料只标记双链 DNA,无需去除 RNA,这能简化您的实验并节省大量时间。Cytrak Orange 是用于双染的橙色荧光染料,可筛选有核细胞中的活细胞,检测罕见活动。DRAQ7 是远红外荧光染料,用于标记透化的细胞,可用于区分死细胞和凋亡细胞。这些染料都可用于多种流式细胞仪系统,它们的优点是有较低的光漂白。大多数染料与 FITC 和 PE都是兼容的。正如我提到过,我们的网站上还提供这些所有产品的详细资源,各位可在演示幻灯片的底部找到这些链接。感谢各位抽出时间,祝您有愉快的一天。下面我将交给 Ina 进行答疑。

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IS:谢谢,Augustine。大家好,感谢各位在讲座过程中参与提问,我们现在收到了很多问题。我现在会回答一些问题。第一个问题是 Sandra 提出来的,她想知道:应该如何进行红细胞裂解?好的,裂解通常是用含有氯化铵的缓冲液来进行的,这基本上会导致红细胞的肿胀或爆裂,这样就能去除红细胞。我建议使用新鲜的缓冲液,细胞处理时间不要太久,因为其他类型的细胞也可能会被影响。个人而言,我有这种经验,用于固定和透化的试剂也能导致红细胞裂解,所以也可以使用这类试剂。

Richard 提出了一个很有趣的问题;他问:我可以用流式细胞术来检测分泌蛋白吗?当然可以,我自己就做过。像我刚刚提到的,流式细胞仪已经改进了,经常用于免疫分型,免疫细胞通常会分泌细胞因子,您可以用阻止细胞因子分泌的试剂处理细胞,就可以测定目标蛋白。通常使用布雷非德菌素 A 或莫能霉素,这些被称为高尔基体阻断剂,它能使蛋白在内质网中累积,这样您就可以进行细胞内染色,检测目标蛋白。

接下来是 Michelle 提出的问题;他想知道:我选择 DyLight 488 和 PE 标记目标蛋白,我能加入 DRAQ7 来筛选活细胞吗?是的,这实际上是个不错的选择,就像 Augustine 刚刚指出的,DRAQ7 对死细胞的双链 DNA 染色,所以可以用于区分样本中的死细胞和活细胞。DRAQ5 的最大发射峰在远红外,超过650nm,因此,这与 488nm 的绿色光荧光和 PE 的黄色荧光完全兼容。

Rachel 有个问题,这差不多是个常见问题排除:我做了细胞内染色,得到了高背景,我该怎么办?好的,这多少取决于您的实验方案,要看你的操作。一般而言,可以试着再清洗一次样品,这可能有助于降低背景染色。您还可以把封闭试剂,例如 BSA或者 血清,加入到清洗缓冲液中,或者加入到抗体的稀释缓冲液中,从而降低背景染色。这取决于您所用的染料,所以对于细胞内染色,我不推荐使用串联染料或大蛋白染料,因为它们可能无法进入细胞,从而得到非特异性的染色。

我们还有一个 Molly 提出的问题;她想知道:我的蛋白没有在研究细胞中充分表达,推荐什么染料呢?这个回答会很简短,如果靶标蛋白质在细胞中表达丰度很低,我会推荐使用更亮的荧光蛋白染料,例如 PE 或 APC,让信号更加醒目鲜明。

然后我们是 Derek 的问题:样品在流式细胞仪上跑样前可以保存多久?这是个操作相关的问题。一般来说,我会建议尽快分析样品,所以越快越好。对于未固定的细胞,绝对要在 24 小时内,固定样品也一样。如果您测定DNA含量,保存时间可以长一点,最多几天。这多少取决于您所用的染料。

是Jan 提出的问题;她想知道:我能用流式细胞术确定细胞的绝对大小吗?不太可能,流式细胞仪虽然很强大,但遗憾的是,它不能告诉你细胞的实际大小是多少 µm。所以你可以参考散点图,我刚刚说过,这里可以看到前向散射光或者前向散射光发出的信号,但是并不能真正的与细胞实际大小联系起来。

最后一个问题。Mark 想知道:怎么研究细胞凋亡? 我认为有很多方法,因为这是个很复杂的流程,可以利用流式细胞仪检测经历凋亡的细胞的光散射或光散射特性的变化,它们的大小和含量会有所改变。可以利用 DNA 染料检查细胞的 DNA 含量,例如 Gus 刚刚提到的 DRAQ5。或者,可以进行 Annexin V 染色,特别适用于研究正在经历凋亡的细胞。所以我认为使用流式细胞仪,可以通过很多方法来研究细胞凋亡。今天讲座的内容就是这些,再次感谢各位的参与,祝各位研究顺利。


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