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ELISA 原理简介和疑难解答技巧

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本次研讨会将概述如何开发自己的 ELISA 实验的有关提示和技术 

听听我们ELISA 专家主讲的点播网络研讨会 

网络研讨会主题

  • 为什么需要使用 ELISA 检测

  • ELISA 检测的不同类型

  • 关键试剂

  • 使用标准曲线定量

  • ​​实验优化及疑难解答 


主讲人简介

Jeremy Kasanov 目前是 Abcam 技术支持团队的一员。他在北卡罗来纳大学教堂山分校取得了生物学博士学位,并在哈佛附属实验室攻读了五年博士后。

Jeremy 主要研究信号转导,他曾运用各类 ELISA 检测方法协助鉴定蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用。


研讨会内容

大家好!欢迎参加 Abcam “ELISA 原理简介和疑难解答”的在线讲座。今天的主讲人是 Abcam 的科学支持团队成员 Jeremy Kasanov。Jeremy 在北卡罗来纳大学教堂山分校取得了生物学博士学位,并在哈佛附属实验室从事五年博士后研究工作。他的研究主要集中在信号转导方向。Jeremy 曾应用各类 ELISA 测定法鉴定了蛋白质 与 蛋白质及蛋白质 与 核酸间的相互作用。​

今天与 Jeremy 一起进行讨论的还有 Abcam 免疫分析产品经理 Catherine Tarrade。现在,有请 Jeremy 开始本次讲座。

JK:感谢 Sarah 的介绍。很高兴能够参加“ELISA 原理简介和疑难解答”的在线讲座。首先,我会介绍 ELISA 的应用,以及最常用的 ELISA 检测方法。然后,我们会讨论在ELISA实验中涉及到重要的试剂和设备,还会提到在决定是自己设计实验还是购买预制试剂盒时需要考虑到的问题。

ELISA 的全称是酶联免疫吸附测定,

通常用于从复杂的混合物中测定特异分析物,还可用于确定分子间相互作用,如蛋白质 与 蛋白质及蛋白质 与核酸间的相互作用等。

与其他免疫测定方法相比,ELISA实验具有很多优势 。实验中使用微量滴定板可以同时检测多种实验条件,并且可以快速地筛选出最优的实验条件。我们可以通过重复测定,从而轻松地获取定量数据,并且由于微量滴定板的孔容量很小,相应的试剂需求量也较少。在整个ELISA测定过程中能够保持蛋白质的天然构象和最佳反应条件,让检测条件更接近于生理状态。

值得注意的是,ELISA 测定并不提供具体信息,例如靶标的分子量,或是在细胞或组织中靶标的分布情况。​

这是标准 ELISA 的简图。在左边,可以看到传统 96 孔微量滴定板的示意图,右边是孔的放大示意图,展示了测定实验的大致步骤。

第一步,我们把靶标结合到微量滴定板的孔上,

第二步,封闭孔,防止靶标与后续测定试剂的非特异结合。

第三步,孵育识别靶标的特异性抗体。这里我们可以看到,抗体上偶联了报告酶标记物。

第四步,加入酶促底物,这时会看到孔里的颜色变蓝,表示微量滴定板的孔中,生成有色产物。随后通过读取分光光度计的吸光度值来确定有色产物的数量。

所有 ELISA 测定实验的基本原理相同。这里我们比较了五种常用的 ELISA 方法:第一种就是我们刚刚讨论的直接 ELISA 测定法。然后是间接 ELISA 的测定法,之所以称之为间接法,是因为靶标的特异性抗体不直接产生信号,而是由与一抗结合的二抗产生。间接 ELISA 比直接 ELISA 更为敏感,这是因为每个靶标的特异性抗体会与多个二抗结合,起到放大信号的作用。 

夹心 ELISA 测定法之所以叫这个名字,是因为靶标夹在,包被在孔上的捕获抗体和检测抗体之间。夹心 ELISA 测定法的灵敏度和特异性甚至比间接 ELISA 测定法还要高。特异性得到增加是因为两种不同抗体都需要与同一靶标结合。灵敏度得到提高,是因为即使靶标分子占总样本比例很小的情况下,每个捕获抗体仍会与靶标分子相结合。

竞争 ELISA 测定法是定量小分子时常用的方法。在竞争 ELISA 测定法中,将与靶标功能相同的,已标记的竞争分子与检测抗体、样本一起孵育。随着样品中靶标分子的浓度增加,能与检测抗体结合的竞争分子变少,此时竞争 ELISA 的信号是降低的。

最后,In Cell ELISA是一种基于免疫细胞化学的定量实验方法,用于测定培养的贴壁细胞的蛋白水平或翻译后修饰。为方便起见,我也根据相对灵敏度、特异性、测定时间和测定成本对这些 ELISA 方法进行了比较。您可以通过查阅我们网站上的protocol部分找到关于这些ELISA 测定方法的更多详细信息。

在确定需要做 ELISA 测定实验后,您需要选择的是,自己设计 ELISA 实验还是直接从供应商那里购买预制ELISA试剂盒。这里,我希望能够与大家一起探讨这个问题,帮助大家来进行选择。

首先要考虑的是费用问题,如果将自行设计 ELISA 所需的试剂成本汇总起来,这笔费用可能会比直接从供应商那里购买一个试剂盒还要贵。但是,如果您长期应用这种实验,并把它作为您实验室的常用分析方法,那么自行设计测定实验就很有必要了,因为从长期来看,这比从供应商那里购买等量的试剂盒更能节省费用。 

时间是另一个重要的考虑因素。直接从供应商那里购买试剂盒产品,第二天就能收到货,这是非常方便高效的。这种试剂盒可以确保开箱即用,其中包含了精确的实验方案和大多数必备的试剂。而自行设计实验可能需要花费数周甚至数月来完成。

费用与使用的频率相关。正如之前提到,如果您经常使用这种 ELISA 测定法,肯定要考虑设计一套供实验室内部使用的检测方案。同样地,如果您的经费充足且时间紧迫,那么您应该考虑购买预制的试剂盒产品。

专业技术水平是另一个重要的考量因素,如果您对自己从头开始设计一个 ELISA 测定实验不是很有信心,那么我建议您不要纠结于费用问题,直接购买预制试剂盒。当然,能否设计一套供实验室内部使用的 ELISA 测定方案,取决于实验室是否具备必要的试剂。即便只缺少一种关键试剂,那么就有必要考虑购买预制试剂盒了。同样地,能否买到预制试剂盒,也要看是否有相应产品。如果您感兴趣的某种 ELISA测定法 还没有预制试剂盒产品,那么只能选择自己设计的实验方案了。

在考虑完这些因素后,假设您现在决定自行设计ELISA实验方案。那么在接下来的部分,我们会更深入地讨论这种情况。

在自己设计 ELISA 实验方案时,需要牢记四个方面,就是确保这个测定实验具有特异性、灵敏度、准确性和可重现性。

这页幻灯片展示了一些自行设计 ELISA 实验时所需要的主要材料。括号中,我列举了能够提高 ELISA 测定实验效率的设备,但这些并非必需设备。实验中需要单通道移液器和多通道移液器,如果能使用数显连续移液器就更好了,可以同时对更多的板进行操作。还需要准备蛋白结合能力高的微量滴定板,如果不具备自动化装置,更推荐使用 96 孔板。因为没有自动化装置,384 孔板使用起来比较困难。实验中至少需要一个喷壶来洗板,如果需要清洗更多的板,建议使用自动洗板机。洗板机会提高您的测定效率和可重现性。当然,你还需要封闭缓冲液、蛋白结合缓冲液,如果您使用酶偶联的二抗,您还需要酶促底物。在孵育时需要盖住板防止蒸发,这是非常重要的。盖板时可以使用保鲜膜,但使用塑料盖或粘合塑料密封膜更为方便。当然,您还需要经测试能在 ELISA实验中应用的抗体。最后,还需要样本和用来读取数据的分光光度计。 

在孔中包被样本或靶标时,需要考虑分子类型。一般来说,大分子蛋白质或抗体易于包被,这类分子会吸附在聚苯乙烯上并且保留被抗体识别的能力。其他类型的分子,例如高度糖基化蛋白、糖类、短肽、脂类和 DNA 在包被到孔之前需要加入生物素或载体蛋白等共价结合亲和试剂进行修饰,才能保留其免疫原性。 

当然,设计 ELISA 测定实验时,抗体是最关键试剂。

需要考虑的一点是,抗体是否已经验证过 ELISA 实验。

例如,Abcam 在抗体产品说明书应用一栏会列出经 ELISA、sELISA验证。ELISA 表示抗体验证过ELISA实验,而sELISA 表示该抗体曾在夹心 ELISA 测定法中用作为捕获抗体使用。

筛选用于 ELISA 实验的抗体时,抗体的克隆性和抗体的免疫原类型也很重要。通常认为单克隆抗体有很强的的特异性,由于多克隆抗体可以识别每个靶标的多个抗原表位。因此多克隆抗体的灵敏度很高。

初步了解抗体的克隆性的影响、以及抗体的免疫原类型是非常有必要的。两种典型的免疫原类型包括短肽、大分子重组蛋白片段或全长蛋白。短肽中可与抗体进行反应的潜在表位范围有限。当然,无论免疫原多大,单克隆抗体只会与单个抗原表位进行反应。但是,即使是由多肽免疫原产生的多克隆抗体,其抗原表位也有限。使用多肽作为免疫原的好处是,即使对于多克隆抗体来说,表位也会限制到很小的范围。这对区分选择性剪接蛋白产物,或检测特异性翻译后修饰产物都非常有用。

使用多肽免疫原有一个缺点,那就是如果全长蛋白处于天然的完全折叠状态时,抗体可能不好接近抗原表位。需要注意使用的抗体是否经过 ELISA 或免疫沉淀等须检测天然蛋白的免疫测定实验验证。 

现在,让我们看下使用大分子重组蛋白片段或者全长蛋白作为免疫原产生的抗体。这种情况下,单克隆抗体仍然只识别一个表位,需要测试其对天然全长蛋白的活性。另一方面,大分子蛋白片段或者全长蛋白免疫产生的多克隆抗体,识别多个不同表位,所以我们就不需要担心它与折叠蛋白不发生反应。而且,多克隆产物会让更多的抗体与靶标结合,从而提高了ELISA实验的灵敏度。

为了更形象地展示我们刚刚讨论的内容,这里您可以看到可使特异性最大化的两个单克隆抗体。但必须确保靶标蛋白与捕获抗体的结合不会阻止其与检测抗体结合。

为使灵敏度和特异性最大化常用的一种方法是夹心 ELISA 测定法,该方法使用单克隆抗体和由全长蛋白产生的多克隆抗体。单克隆抗体会保证特异性,而多克隆抗体则提高了灵敏度。要降低夹心 ELISA 测定法的假阳性结果,我们需要确保结合了酶标记物或荧光分子的二抗不会与捕获抗体结合。例如,如果捕获抗体是小鼠抗体,那么就应该使用不会识别小鼠免疫球蛋白的二抗。一般而言,夹心 ELISA 测定法会使用不同宿主来源的捕获抗体和检测抗体。

抗体纯度是另一个重要因素,尤其是选择用于夹心 ELISA 测定法的捕获抗体时。

未纯化的抗体,例如来源于全抗血清、组织培养上清液或腹水中的抗体,除了含有靶标特异性抗体外,还包括其他蛋白分子。

当然,纯化后的抗体只包含靶标特异性抗体,能够与更多的靶标结合,因此提高了灵敏度。

自行设计 ELISA 实验时,缓冲液是另一个重要考虑因素。首先,让我们先来看下包被缓冲液。包被缓冲液是用于稀释靶标,使其结合至孔表面的缓冲液。重要的是,这种缓冲液不能含有外来蛋白,也必须与样本兼容。这意味着样本必须保留所有关键的生化特性,例如溶解度、活性和折叠状态。封闭缓冲液应保证其最低的背景,不干扰任何测定组分与之发生反应,也不应具有任何可能导致假阳性的酶活性。

这里,我列出了一些最常用的 ELISA 报告酶和底物。碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶是最常用的报告酶,因此,根据这些酶开发了多种酶底物。不同底物在信号、灵敏度和成本方面有所不同。三大类型的底物包括显色底物、荧光底物和化学发光底物,其中显色底物产生有色沉淀,可通过分光光度计读取吸光值。我们可以看到,这些底物检测范围差别很大,从碱性磷酸酶底物 pNPP 的 100 ng/ml,到 LumiGLO HRP 化学发光底物的 25 fg/ml(据说可达到的灵敏度)。这里要重点考虑的是检测方式。我们需要使用正确的设备来检测显色、荧光或化学发光信号。灵敏度是另一个重要因素。灵敏度最高的底物并不总是最好的选择,因为这可能会导致高背景,或者变化太快的信号产生。

从 ELISA 实验中我们可以获得两种数据:一种是定性数据。这里有两个定性数据的例子。左边的是例一,这个实验表示,从细胞中提取样本,使用能提高某些样本中蛋白表达量的不同药物进行处理。也可能表示不同序列的噬菌体展示多肽及其对某种靶标蛋白的相对亲和力。例二表示,增加药物处理的浓度,可使蛋白表达水平增加。

ELISA 方法还可提供定量数据。这里是使用我们的 IL-6 ELISA 试剂盒获得的标准曲线。我将用这个例子来说明,我们如何通过与标准曲线进行比较来定量样本中的目标蛋白。

例如,假设一种未知样品的读数是 0.7 OD。我们可以根据标准曲线来估算未知样本中 IL-6 的量,

或将数值代入直线方程式,得到更准确的数据结果。所以,根据这个例子,我们可以看到利用标准曲线来定量未知样品是非常简便的。

我们刚才讨论了自行设计 ELISA 测定法的重要因素,现在让我们再看看实验优化和常见问题。

这里是对捕获抗体的上样量进行了优化以减少浪费的例子。针对这一抗体,我们使用四种捕获抗体的稀释液,可以看到,该抗体的 100 倍全稀释液使用的抗体量少,但是灵敏度更高。

这里还有个反应缓冲液组分得到了优化的例子。目的是使用最大量的氯化钠来保持最强的信号。根据这个的数据,我们可以确定 300 mM 的盐浓度是最理想的。

可能您已经意识到了,在进行 ELISA 测定时存在很多变化因素。这让 ELISA 测定成为较难进行疑难问题排除的免疫测定应用。在常见问题排除和必要的后续优化过程中,有四点重要的信息需要注意。基质效应被认为是由抑制预期抗体-抗原相互作用的干扰物质而产生。这些干扰物质可以是其他抗体、蛋白分子、或小分子物质等。在对血浆样本进行测定时尤其容易发生基质效应。要确定是否出现了基质效应,在样品中加入阳性对照抗原是一个很好的办法。如果这些对照抗原的信号比预期低,那么就可能存在基质效应。 

假阳性结果中出现的信号,可能归因于非特异性或非预期抗体的相互作用,或者是由增强假阳性信号的缓冲液或样本组分引起。例如,竞争 ELISA 测定法中被标记的竞争化合物可能会降低其对检测抗体的亲和力,导致了虚高的读数。

假阴性结果表现为信号虚低或缺失。这种现象的常见例子是钩状效应。如果靶标分子比检测抗体的数量要大得多,那么就可能出现钩状效应。这会导致不断增加分析物使得信号明显减弱的情况发生。

最后,在每块板上都应设置阳性对照和阴性对照。如果有纯化的目标蛋白,就可用作阳性对照并制作标准曲线。

这里有个关于常见问题排除的具体例子,特别说明了数据一致性的重要性以及 ELISA 方法中重复测定的作用。左图中,金色标记的部分是标准曲线的点。箭头表示了标准曲线,这是根据标准曲线来确定两种未知样品的浓度。

这里特别显示圈起来的数据点,是因为该值出乎意料地高。

一种可能的解决方案是从标准曲线中去掉这部分数据点。在这个例子中我们可以这么做,是因为我们还有其他很多一致的数据点。

我们可以看到,去掉一个错误的数据点极大地改变了标准曲线的形状,同时也改善了数据质量。比较两个实验中的误差百分比,我们可以看到误差百分比从上面数据组的 56% 大幅下降至 10%。同时可以看到未知样品的浓度也发生改变。对于样品一,校正后浓度从 66 ng/ml 变为 127 ng/ml。对于样品二,校正后浓度从 52 ng/ml 变为 100 ng/ml。从这个例子中能体现出仔细进行数据分析的重要性,以及 ELISA 测定法的用途。

最后,我还有一些 ELISA 相关的资源介绍给大家。

这是典型的 96 孔微量滴定板的示意图。这种网格形式会对您的 ELISA 实验设计很有帮助,也非常适用于保存实验记录。

记录 ELISA 测定中所用的每个试剂是非常有必要的。很重要的是不仅要记录产品目录号,还要记录产品批次号,这个例子展示了在捕获 ELISA 测定法中记录所用试剂的一种方法。

Abcam 有丰富的实验方案库,包含了各种免疫测定技术。要浏览这些方案,请点击在科学支持链接上,选择方案和常见问题排除。

在这里,您可以选择按应用或按研究领域来浏览方案。

例如,我们现在列出了 13 种 ELISA 方案,可以在我们网站上查看,或者打印为 PDF 文档查看。现在,我想介绍我的同事 Catherine,她会为大家介绍我们的免疫测定产品目录。


CT:谢谢,Jeremy。我将用几分钟介绍下 Abcam 的免疫测定产品目录,包含了 1,000 多种经优化的 ELISA 试剂盒。试剂盒能帮助我们轻松地锁定预期靶标。Abcam 提供了全面的 ELISA 试剂盒, In Cell ELISA试剂盒以及dipstick assays产品。我们常规的ELISA 试剂盒覆盖了 500 多个靶标,并且包括多种的 ELISA 测定方法:包括夹心法、间接法、竞争法。我们的试剂盒还可用于不同的检测方法:如比色检测、嘌呤检测和红外线检测。

说起 ELISA,让我介绍一种全新的磷酸 ELISA 试剂盒,叫做 PhosphoTracer。PhosphoTracer ELISA 试剂盒用来检测蛋白磷酸化,比蛋白印迹法更加灵敏。不同于其他实验步骤,这一方法将分析物和测定试剂同时加入到微孔板中。只要一个小时我们就可以测量。例如,可用来检测磷酸化Akt 蛋白、JAK-STAT 蛋白。

我们也有In Cell ELISA试剂盒用于培养细胞中测量蛋白的相对含量。另一种有趣的测定方法是dipstick 分析实验。该产品利用完善的横向流动概念,使捕获抗体以条纹形式排列在硝酸纤维素膜上,让样本通过抗体带。将样本加入到孔中后插入试纸条。几分钟后就可以看到每个目标带,蛋白质检测物质(通常是金复合体)与捕获抗体结合。

正如我之前提到的,我们为每种 ELISA 方法提供了广泛的蛋白靶标。ELISA 试剂盒主要用于检测细胞因子、细胞因子受体、生长因子、心血管蛋白、癌蛋白或磷酸化蛋白。In Cell ELISAs适用于信号通路研究,缺氧、线粒体生物合成抑制剂和激活剂。而dipstick实验可以用于追踪复合体 I 蛋白、丙酮酸蛋白酶、脂肪酸氧化相关酶。 

下面介绍下关于ELISA实验几个常见问题。

一个问题:对于ELISA 测定来说,如何设置正确的对照呢?

对于常见类型 ELISA测定来说,只要孔中没有目标蛋白,就是良好阴性对照了。所以,您需要做的就是,将封闭缓冲液加入孔中,而不加入目标蛋白。这种做法也让您了解到封闭缓冲液的效果如何,此外还可以知道,未加入特异性靶标时的背景信号是怎样的。经典的阳性对照可以是纯化的目标蛋白。您可能要对阳性对照蛋白进行一系列稀释,用于制作标准曲线,以及验证所用测定法的预期效果。

下一个问题:怎么做来降低高背景呢?

要降低高背景、得到最佳信噪比有很多种方法。我想,最简单的一种就是对测定中的抗体稀释度进行优化。如果用的是夹心 ELISA 测定法,可以优化捕获抗体浓度,或者优化检测抗体、或带有报告分子的二抗。使用太多报告分子容易增加测定的背景。 

降低背景还有一个很有效的方法,就是增加洗涤次数。通常我会推荐大家每加入一种试剂要清洗至少五次。我们还能做的是增加洗涤缓冲液的浓度,进行更彻底的清洗。 

降低背景的另一种重要方法是更换封闭缓冲液。有多种我们可以尝试的封闭缓冲液配方,但没有一种是绝对适合的封闭缓冲液。所以我们可以尝试标准封闭缓冲液,如,5% 牛奶封闭缓冲液,也可以试一下包含 1% BSA 的缓冲液、含血清的缓冲液,还有各个公司出售的其他缓冲液专利产品。对于降低背景来说,封闭缓冲液是一个的关键试剂。

下一个问题:加入酶底物之后没得到任何的颜色变化。

有很多不同的原因都能导致得不到任何信号,就像我在讲座里面提到的,有时候对 ELISA 测定进行疑难解答是很棘手的,因为加入了这么多不同的试剂,有太多各种各样的可能性错误。比如说,可能是抗体问题,ELISA 测定中所用的一个或多个抗体可能没有达到预期效果。可能是没有与目标蛋白发生反应。也可能是目标蛋白中没有针对这个抗体的表位。例如,使用夹心 ELISA 测定法时,需要检测用作捕获抗体的抗体,是不是能真正发挥捕获抗体的功能。因为有时候,抗体作为检测抗体时功效不错,但作为捕获抗体时就不大好用。所以经常人们能做的就是收集一些不同的抗体,在不同的情况和组合中进行测试,以确定哪一个抗体能给出最佳信噪比。有时候很难预测,但这通常是最好的办法了。也可能是样本的问题;也许根据您的 ELISA 设计,抗体的预期靶标并不在可检测水平上。

如果有阳性对照时依然出现这个问题,那么就要需要重新考虑了。如果是从供应商那里购买的试剂盒中获得的阳性对照,那要确定稀释步骤是否按照推荐方案进行,还有对照蛋白是否按照推荐方案进行存储和稀释,这些都很重要。例如,如果不小心使标准品稀释过度,可能就得不到您预期的结果了。

女士们,先生们,今天的在线讲座到此结束。如果您有任何关于 ELISA 的问题或者科学咨询,我们的科学支持团队很高兴为您服务,请发邮件至 cn.technical@abcam.com。希望能在下一次在线讲座中再次与您相约。再次感谢各位参与本次讲座,祝各位研究工作顺利。


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