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流式细胞仪颜色补偿网络研讨会

观看这场由 Graham Pockley 和 Ian Dimmick 主讲的自选网络研讨会

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了解硬件配置、仪器设置和染料的考虑因素。

Flow cytomery webinar

网络研讨会主题:

  • 选择仪器配置
  • 确保您将得到怎样的光子
  • 选择荧光染料
  • 您的对照是否有用?

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主讲人简介:

Graham Pockley

Graham Pockley 现任英国诺丁汉特伦特大学 John Van Geest 癌症研究中心副主任。他重点研究的是健康和疾病中的免疫调节机制。Graham 在他的职业生涯中一直使用并支持流式细胞术。

Ian Dimmick

Ian Dimmick 的事业始于临床领域,他曾在多个研究岗位工作,并将流式细胞术作为 HIV、白血病、淋巴瘤和各种免疫学检测的主要诊断和研究工具。Ian 现在负责管理英国纽卡斯尔大学的流式细胞仪核心实验室。


网络研讨会文字记录:

大家好!欢迎参加 Abcam 的流式细胞仪颜色补偿网络研讨会。今天的演讲嘉宾是 Graham Pockley 和 Ian Dimmick。Graham 的研究方向主要集中在健康和疾病中的免疫调节机制。他现在是英国诺丁汉特伦特大学 John Van Geest 癌症研究中心的副主任。Graham 在他的职业生涯中一直使用并支持流式细胞术。

Ian 的事业始于临床领域,他曾在多个研究岗位工作,并将流式细胞术作为 HIV、白血病、淋巴瘤和各种免疫学检测的主要诊断和研究工具。Ian 现在负责管理英国纽卡斯尔大学的流式细胞仪核心实验室。

今天与 Ian 和 Graham 一起为我们带来讲座的还有在 Abcam 波士顿办事处工作的供应经理 Ken。在我们开始之前,先简单提醒一下,在网络研讨会期间,您可通过您屏幕右侧的问答面板提交任何问题。另外,当您退出这次网络研讨会时,界面会跳转至一个页面,您可以在那里下载演示文稿的副本。现在,就有请 Graham 开始本次网络研讨会。

GP:    谢谢 Lucy。欢迎各位参加今天的颜色补偿网络研讨会。正如 Lucy 所说,我的研究中有大量时间花在了流式细胞术上。我认为,如果流式细胞术有某个方面仍然引起关注,那么它应该是关于色彩补偿以及介绍如何正确设计实验的。随着新一代仪器中激光器和检测器数量的增加,这些问题只会越来越难解决。在我把这场网络研讨会的主要部分转交给 Ian 之前,我们先大致浏览一下今天将要讨论的网络研讨会核心内容。那么,我们今天要讲的是:为什么要做多色实验?我想,也许我们对此都有自己的看法,但重要的是要考虑:我们为什么做多色实验?这有必要吗?实验提供的信息将在多大程度上帮助我们深入理解特定实验问题?目前有各种各样的荧光染料,在这些实验中究竟应该使用哪些?什么是光谱重叠?为什么我们需要补偿?还有一项核心内容是:补偿的过程是什么样的?

在实例中看问题是最好的,所以 Ian 会带我们浏览一些溢出的情况,并讨论如何计算溢出。对任何实验过程来说,在实验中设置正确的对照都是至关重要的,所以他也会讨论实验设计的相关内容。言归正传,现在让我把时间交给 Ian。再提醒大家一下,如果您有任何问题,不必等到研讨会结束,您可以在会议进行期间将问题提交给我们,这样我们可以在网络研讨会进行过程中就开始试着回答。Ian?

ID:    非常感谢,Graham。我们来看第一个问题:为什么要做多色实验?对于我们的全部研究而言很关键的是,我们实际上是从实验中积累尽可能多的数据。下面一张幻灯片将有力地向您展示,如果我们在两个管中使用例如六种抗血清,那么,您会看到,您最多将从中得到 18 种表型。因此,您只能得到由每管抗血清表示的实际表型。

然而,如果您将六种抗血清(在这里由每管三种抗血清表示)全都放到一个管中,您就可以看到,这些较暗的区域是饲养细胞类型,这是将抗血清分在两个管中时永远不会看到的。所以,如果您认识到,您只需要在更昂贵的仪器方面或许多一点考虑,在实际实验设置和实验方案本身上多花一点心思,您就能够大大增加可从实验中提炼出的数据。这里得到了 36 个离散的表型,比 18 个表型翻了一倍。不过,这里没有显示非离散表型,因此当您开始研究可以在离散表型之间看到的非常细微的表型变化时,会增强倍增效应。您将得到的数据量也会呈指数增加。

这就引出了一个问题:我该使用哪种荧光染料?这是一个极其关键的问题。您不能只是登录到网站的目录上,然后随便选择适合您所用激光的荧光染料。您需要考虑在实际创建实验时会遇到的相当多的变量。荧光染料基本上都以相同的原理工作,我们用激光激发荧光染料,而该激光应大致在荧光染料的最大消光系数范围内。一旦电子进入相当不稳定的较高轨道,它随后就会回到稳定的轨道。在这个过程中有一定量的散热,这是由激发波长和返回到更稳定构型时光子的发射波长引起的,发射波长总是比激发波长更长。这是所有荧光染料都会出现的基本状况,您将以较低的波长进行激发,然后将接收更高的波长。

这个极其有用的工具是光谱查看器,这个工具的优点在于它让您在一定程度上能够查看哪些荧光染料适合您的特定仪器。但是,请记住,这是高度图形化的,很多时候您可能会被这个工具误导。所以使用这个工具时要非常小心,不要根据这个工具来排除荧光染料。不过,就其基本功能而言,它是一个特别有用的工具。

如我已经讨论的那样,荧光染料本身是按照消光系数被激发的,其在所吸收的某个最大波长下被激发,并且在该波长下的激发是最佳的。在很少的几个例子中,荧光染料的激发从不在最大吸光度处,而是与最大吸光度差很远。发射是通过量子荧光描述的,发射程度由该特定荧光染料的量子荧光描述。我们为量子荧光提供的值是在全光谱发射值上测量的值。您不用测量荧光染料的全光谱发射,除了在使用非常广谱的长通滤光片时偶尔会需要,但并不在您的仪器上测量;再说这也不会是常态。因此,您所得到的表示荧光染料的理论值应为消光系数乘以量子荧光,实际上这个理论值从未达到,但会给出消光系数和量子荧光。通常量子荧光的这个值在 0.5 到 <1 之间,恰好不到 1,是一个理论性的值。不过,这很像光谱查看器,它可以指示您正在处理什么,但它不会是一个能提供绝对值的有限值。

这是一些非常有用的值;这些染色指数基本上代表了这些荧光染料的功能,这些荧光染料被放到细胞上,然后用流式细胞仪检测,您可以看到阴性染色细胞,与阳性染色细胞形成对比。就该荧光染料的亮度而言,这个染色指数是非常好的值。  应该记住,所有这些值都取决于您所处理的细胞的量子荧光、消光系数、自发荧光,还有激光器的功率和仪器的滤光片设置。因此,不要将这些值理解为您能够在特定仪器上获得的有限值,这取决于仪器、细胞以及激光器的功率。

GP:    Ian,插一个我们正在浏览的问题。染色指数值在很大程度上取决于仪器,但荧光染料的顺序是否在任何情况下都应该一样呢?

ID:    是的,顺序应该与您眼前所看到的非常类似。没错。这就像我们以前听过的说法那样,将“最亮”的荧光染料留给细胞浓度最低的抗原。另外,为您抗原中细胞浓度最高的抗原保留不太亮的荧光染料,这只是一种常识方法。

这里您可以看到,染色指数是由来自细胞的信号表示的,该信号由这个正峰表示,但也可由自发荧光的宽度表示。所以,染色指数是从负峰到正峰的这段距离除以可由细胞负峰部分得到的宽度或标准偏差。标准偏差非常重要,因为,正如您所看到的,就拿这个窄峰来说,相比于使用诸如间充质干细胞或胚胎干细胞这种与淋巴细胞相比具有高度自发荧光的细胞,从正峰到这个窄峰的距离会大得多,因此染色指数也会随细胞类型以及仪器的不同而变化。

荧光染料的类型可以大致分为三类:第一类是非串联荧光染料,这种非常容易处理,简单明了;第二类是串联荧光染料。串联荧光染料非常好,虽然它们存在易降解的问题,但是只要您妥善处理就不会有问题。第三类是 Qdot。这一类荧光染料特别有用,但使用时需要些技巧。

这是非串联荧光染料的一个例子。在这里我们可以看到这种特殊的染料,这是一种紫色激光染料 Brilliant Violet 421。这里的染料是一种 V450 染料,您可以看到,这个 Brilliant Violet 421 比这里的 V450 染料亮得多;您还可以在这个叠加图上看到这一点。这是非常有用的第一步,如果您的抗原浓度很低,那么您可能会需要这种染料,而不是这种染料。

当您查找和确定实验中需要使用的荧光染料时,另一个优点是,沿着这些荧光团中大部分的红色拖尾会蔓延到的地方,您需要从例如下一个 PMT 获得多少补偿?正如您所看到的,对于这种 Violet 421 染料,从检测染料的 525 nm 到 450 nm 的补偿为 14%;所以对于这种检测器需要的补偿为 14%。再看看 V450,这种染料的补偿是 30.4%。所以这里的 Violet 421 染料不仅更亮,而且进入下一个 PMT 检测器的光谱重叠更少。因此,平心而论,现在有两个原因让我们考虑 Brilliant Violet 421 染料而不是 V450 染料。然而,必须说,只要您意识到了光谱重叠的问题,这两种染料都同样能够很好地用于任何实验。只要您知道,您可能需要为更高浓度的抗原选择 V450,而对较低密度的抗原使用 V421;并且要注意 V450 的补偿要稍高一点。您需要确保您应用于此实验的电压可以增加需要的补偿。

串联染料本身:这个例子从根本上解释了为什么要生产串联染料,它最初旨在由单个激光仪器激发额外的染料。这里我们使用藻红蛋白,其在 488 nm 光下被激发,并将发射 580 nm 的光。我们再看看 Cy5;Cy5 染料被 633 nm 激光激发,并发射 675 nm 的光。现在,我们使用两种激光:用这种蓝色激光激发藻红蛋白后得到 580 nm 的发射光,而用这种红色激光激发 Cy5 后得到 675 nm 的发射光。然而,如果将这两个分子放在一起,您能够构建一个可被蓝色激光激发的藻红蛋白分子,其在 580 nm(这足够接近 Cy5 的 633 nm 激发光谱)下转移能量。这样您将得到一个分子,就像您可以在这里看到的,这个分子在 488 nm 下被激发,然后发射 675 nm 的光,从而为蓝色激光的激光波长和发射波长提供了第三个选择。

这张幻灯片描述了一些您的串联染料出现问题的原因,图中的这种串联染料来自 FACSCalibur。如果您要构建这种染料 — 如果我没记错的话,这是 PeCy5;如果您要构建这种串联染料,那么在室温下准备好样品 20 分钟后,您需要 20.98% 的补偿,这从激发到发射是完全可以接受的。如果您将样品在 4°C 下放置了 24 小时,则串联分子会发生降解,这意味着由于有键合被破坏,激发或供体电子分子开始有少许渗漏,于是补偿升高到 22.75%,这是完全可以接受的。但是,如果您将样品在室温下放置了 24 小时,则由于供体分子的渗漏,补偿升高到 34.59%,这显然是不可接受的。这说明了两点:如果您对样品进行了正确的处理,那么您确实必须力图在补偿方面做出改变,而如果您将样品放在室温下,那么染料明显会降解。所以您应该小心地处理串联染料。

Qdot 是相当好的荧光团,它们具有许多优点,但我认为主要的优点是 Qdot 可以几乎专一地被低于其发射波长的波长激发。所以 Qdot 的消光系数曲线是这样的。这里这个 Qdot 是 Qdot 605,它可以被低于这个发射波长的任何激光激发。然而,如您所见,消光系数不断降低,发射的有效性开始降低量子荧光和激发的程度,并随着越来越接近发射光谱而减小。其次,Qdot 本身具有非常均匀的发射光谱,它没有典型的像这样的红色拖尾;它具有非常均匀的发射光。这意味着,相比于使用普通荧光染料,使用 Qdot 通常需要更少的补偿值。这是 Qdot 的结构,发射光谱依赖于组成半导体核心的分子的实际大小;分子越大,产生的发射光谱就越高。

而且,用于实际抗体的结构也有所不同。这是一种与荧光染料结合的抗体,这是激发波长,这是出现红色拖尾的发射波长。这里 Qdot 实际上位于中心,抗体结合到 Qdot 上,所以这是这幅图完全矛盾的地方。此外,这里一直存在吸收。它没有特定的消光系数最大值,它一直存在。您可以看到发射光,如果您把这里的发射光和这里的具有长的红色拖尾的发射光相对比,只需注关注我所说的实际光谱。

但什么是光谱重叠?我们如何看待它?为什么需要补偿?我们现在需要后退一步来实际地想象一下,当我们试图创建实验时会发生什么。我们在仪器内部模拟自身光谱重叠,在光电倍增管前装一个滤光片,光电倍增管将实际测量荧光染料的发射光。这里我们将测量 FITC 这种特定荧光染料在 520 nm(加或减10 nm)下的发射光,这通常要在检测器前查看。这是 FITC 的发射光谱。整个量子荧光值是这条曲线下的区域,不过,我们只测量这部分发射光谱,因为这是设在检测器前的滤光片的边界,所以我们将测量该限定曲线下的区域。

这是藻红蛋白滤光片,另外在该滤光片的另一侧有一个藻红蛋白检测器,正如您所看到的,藻红蛋白检测器实际上会测量 FITC 分子发射光的红色拖尾导致的溢出。如果您不使用任何类型的颜色补偿,您将会在仪器中看到这种效果。这显然是错误的,我们要避免这种情况。这是藻红蛋白。现在,正如您可以看到的,这里有少量的藻红蛋白进入 FITC 检测器,这里是将要测量的藻红蛋白发射光谱,这里是不会被测量的。

这是将实际测量尾端和这些荧光染料的四分之一的另一个滤光片。这里有发射滤光片,所以这里我们需要两个补偿值,一个用于 FITC,另一个用于藻红蛋白,以便正确测量这种特定荧光染料。这是溢出值,这是这里的溢出值。

当我们实际进行多色操作时,情况就是这样的。现在,对于每一种这些荧光染料以及每一种这些检测器,你确实需要一次又一次地做相同的基本操作。对于每一个单独的检测器来说,这并不比对它们进行相同的基本补偿更复杂。可能在某些情况下,你需要从 PMT 中减去 4 种或 5 种荧光染料,或者也许仅一两个,就像这里的情况,但每种情况的处理机制都是相同的。那么您的点图是什么样子? 这是藻红蛋白的光谱重叠,这是我们的 FITC 分子,这是我们的 FITC 信号:阴性细胞和阳性细胞。这是 PE 检测器中错误的 FITC 信号,它长这样。它实际上真实地反应了这里发生的情况,在这里我们可以看到 FITC 信号,也可以看到 PE 信号。结果是,当我们把这个补偿拿走,在这里和这里都出现了光谱重叠,那么这是阴性细胞。这是 FITC 细胞。我们来看看藻红蛋白的阴性相对于阳性的平均值。我们来看这个阴性相对于阳性的平均值。对于任何双重染色样品,我们看看将这个细胞置于这个象限内的 PE 和 FITC 百分比多大程度上与这个细胞上的 FITC 和藻红蛋白成正比。

那么这里是 FITC 和溢出,如果这里没有被减去,这儿就是 FITC 细胞的位置。一旦减去,细胞将返回 x 轴。所以如果我们减去这个,那么结果就是:信号离开 PE 检测器,我们得到的阴性和阳性平均值是一样的。

补偿不应该有问题,并且这是非常简单的调整仪器的方法。这是一个相当复杂的图形,但是基本上这里有 5 种激光 LSL2,在这里您可以看到以高度显示的滤光片值和每个图形中的值。那么您可以看到,这些高度,当然,在这里是非常相似的。所以如果您运行两种荧光染料,并且它们被每一个滤光片捕获,那么补偿就会很高。不过,如果我们在这里做这样的具体设置,使用紫外线激光激发,那么在这里运行像 Alexa 350 此类的任何荧光染料或者运行 Qdot,将很少发生光谱重叠,因为这里的滤光片值不同。因此,PMT 越多,通常滤波片就越接近,从而补偿值就越高。这些都不是问题,但是您应该像这样配置您的仪器,光电倍增管前放置一些滤光片,以确保当您用这些光电倍增管检测特定荧光染料时不会出错。

所以补偿与荧光强度无关,但许多人对此一直有疑问:为什么,原因在哪? 这很简单,这里是信号的强度,这是一个绿色信号,假设是 FITC 信号。补偿是这个黄色检测器内的溢出,这表示,假设是10%,而这是这个绿色检测器中值的10%。如果在这种情况下荧光强度下降,那么这仍然是这个值的10%。所以光谱重叠完全不受强度的影响。如果您发现,由于荧光强度的不同而需要采用不同的光谱重叠百分比,那可能是因为最初的补偿设置不正确,或者你换了不同型号的荧光染料。

但是,如果这个绿色检测器的灵敏度增加,无论是通过增加 PMT 电压还是仪器被人重新调整而变得更灵敏,这里是通过增加 PMT 电压实现的,这个补偿值将会降低。所以,再者,我们可以安心的就是,通过增加另一个检测器的灵敏度或 PMT 电压,实际上可以降低补偿,这是一个非常重要的信息。增加 PMT 并不一定意味着增加颜色补偿值。再者,您要从什么颜色中减去什么颜色? 您有一个绿色荧光染料,使用黄色检测器,您就只能减去绿色。如果您有一个红色荧光染料,那么在黄色检测器中就只能减去红色。记住,您不能减去颜色自身的颜色,所以对于黄色,必须是绿色减去黄色,对于绿色,必须是黄色减去绿色,而对于这里的黄色信号,用红色减去黄色,对于红色信号,用远红减去红色。所以请记住这个图。

我们已经讨论过 PMT 电压以及它们如何影响补偿。把 PMT 电压放在补偿控制的第一位,因为如果差异很大,或者如果你没有认真了解所使用的荧光染料而 PMT 电压又有差异,它将会严重影响你的补偿值。同样重要的还有可用的激光,首先确保具有适合待用荧光染料的激光。荧光染料本身显然在这方面起了重要的作用,还有我们已经讨论过的配置过滤片的仪器。因此,如果您的过滤片非常接近,即顾及滤光片的公差和滤光片的位置,补偿将不受荧光染料的影响。所以要慎重考虑仪器滤光片的配置。

再者,补偿过程是一个非常简单的过程,它以基本规则工作并且操作并不复杂,但是你必须非常明智地应用这些基本规则。举个例子,如果我们要进行包含 CD3-FITC、CD8-PE 和 CD19-PerCPCy5.5 的三色实验,那么首先要做的就是,通过单独运行每种荧光染料并(如有需要)应用补偿来检查光谱重叠。所以第一管只运行 FITC,第二个管只运行 PE,这是结果,我们可以立即看到需要补偿什么。另外需要记住的是,在这个三色实验中将所有染料进行组合有很大的好处,每种荧光染料都可以相互对照,你可立即知道补偿的要求。在三色实验中,这是非常简单的。但如果你做的是13种颜色,从整体来看它几乎也是不可避免的。

那么在轴上查看 PE 图谱是否有光谱重叠,这里很明显有光谱重叠。这是 PE 轴,这是 PE 的光谱重叠,然而他们需要调整,就像这样调整。再次,对于每种单独的荧光染料,每次操作都要调整阴性平均值和阳性平均值,然后当您运行三重染色样品时,您就可以很好地分离每个荧光团。

溢出的例子:如果你正在运行一个多激光多参数仪器,要想知道以后会不会出问题有一个非常简单的方法,那就是观察荧光染料的溢出。我们通常可以这样做:将抗体和我们想要在实验中看到的特定荧光染料放到抗体捕获珠上。在这里,如果是 Qdot 605,我们可以看到,这是 488 激光,激发 610 的光,公差为 20 纳米,那么 600 至 630纳米的激发光可很好地检测 605 Qdot。您可以看到,这里的 Qdot 非常好非常亮,而这里不太亮,这里也不太亮,所以这些是很容易补偿的。不要被这个误导,这实际上是抗体捕获珠的自发荧光。还要记住,您必须将这些测量进行对照。红色峰值是外周血淋巴细胞,这是我们为观察淋巴细胞而设置的实验,并且我们在这些未染色的淋巴细胞上设置了所有电压。因此在进行任何这类抗体荧光测试之前,您需要合适的电压。

这里我们用藻红蛋白作为示例,这里是蓝色激光,这里是藻红蛋白通道,它非常好。您可以看到,正如我在 Excel 图中所展示的,57525 和 488610 滤光片离的非常近,您可以看到 57525 通道中藻红蛋白的平均荧光强度值和 488610 通道中的设置电压。这些值非常接近,您将需要大量的光谱重叠来将这个藻红蛋白信号从 610 中移除。当我们进一步远离 488575 藻红蛋白峰值发射光时,您可以看到很容易将光谱重叠纳入考虑之中。至于其余的激光,这是紫外激光,这是紫色激光,这是红色激光,而藻红蛋白根本不会真正进入这些检测器。所以您知道该做什么。

再比如,您可以在看到,这里紫色激光激发 Pacific Blue 发射 450 nm 的光,这是一个很好的荧光。这里 525 nm 发射光要少得多,您可以通过普通的光谱重叠来消除它。您还可以看到,Pacific Blue 并没有被任何其他激光所激发。这对您们来说是非常有用的信息,因为当您设计多色实验时,需要知道这些荧光团是否会被其他激光激发。并且当您将荧光团与多色实验中可能的弱双阳性结果相结合时,您也需要考虑这一点。

这是 PeCy5,然后这里是使用 PeCy5 的一个绝好例子。在实际情况中,首先使用此处的这些基本电压,这是超出刻度的信号,即使在 5.4 个 log 数量级 (log decade) 下也超出了刻度。这一切都是围绕这个 Y 轴的,所以最重要的是您可以轻易地降低这里的电压。它在这些检测器中非常亮,所以如果您降低这个电压,会出现高补偿问题,当然是在这里的检测器。而用红色激光激发的 Cy5 分子也可以单独地由 PE 激发,这同样会引起问题:就大染料载体而言,我们将很难得到弱阳性结果,可能是 APC 弱阳性和 PeCy5 阳性;这是不可行的。所以这强调了这个荧光团实际上被多个激光激发,它是 PeCy5 分子的光子受体部分,也就是被该激光单独激发的 Cy5 分子。

GP:    我想提醒大家一下,请大家继续提问,我们会在会议结束或离线时尝试回答这些问题。我们现在已经晚了几分钟;网络研讨会将继续进行,请不要走开,我们会在今天下午收获关键信息,这很重要。我们的研讨会时间会稍微超出一小时,但正如我所说,请不要走开。谢谢 Ian。

ID:    现在我们来讲一下颜色补偿中相对简单的部分,那就是溢出计算过程和您应当使用的对照。在这里我们可以看到,使用蓝色激光激发 PeCy5.5,前面为 710 nm 带通滤光片,得到了这个漂亮的阴性结果,还有这个漂亮的阳性结果。如果得到像这样的非常明亮的信号,并且许多细胞是阳性的,而且阴性细胞群也很好,那么可以很容易地进行补偿。

这里您可以看到,我们的点图从这种未补偿的点图变成了这种点图。我们知道这些抗原是相互排斥的,所以问题在于用阴性结果校准阳性中值,以及用阴性结果校准这里的阳性中值。这并不经常发生,那么我们需要做的就是在使用基底细胞进行实验后,必须运行附着在抗体捕获微珠上的荧光染料,以便从每种荧光染料得到明亮的阳性信号。这些特定微珠的表面具有抗-kappa 抗体,微珠是通过 kappa 轻链与抗体结合的,荧光染料会出现在这里,然后您就得到了表面上具有特定荧光染料的特别亮的微珠。

这种溢出的计算和荧光染料的组合规则是:弱抗原使用明亮的荧光染料,并区分补偿和数据操纵,如使用 PeCy5 的情况。如果荧光染料被多种激光激发,则需要评估其是否可用于多色实验。始终通过单色对照来评估抗原的百分比,这是非常重要的。如果您正在进行十色实验,那么请为这十种抗原中的每种运行单色对照。确保您大致知道这十种抗原的阳性值,然后当您运行多色实验时,确保将所有十种颜色添加到一起时,您得到的差不多是相同的百分比。实验中补偿值越低,实验越稳定。

这里,我们要区分补偿和数据操纵。这是用绿色激光激发的 Cy3,效果非常好。这是用蓝色激光和绿色激光激发的 PE;这绝对正确。用绿色激光和蓝色激光激发 PE 使其发射光线并穿过前面的滤光片,两种情况下使用的滤光片都是特定且相同的,并且绿色激光和蓝色激光激发 PE 后发射光的值也是相同的。然后就会得出这样的结果,这是没有问题的。我们在这里得到 CD19,我认为这里是 CD3。这是正确的,您不应该对它进行补偿。如果您在那里进行补偿,您就会得到一个高亮的染料载体,这是数据操纵,不是补偿。


这是找出不同激光的可激发染料的一个非常简单的方法。这里用蓝色激光激发铬橙,而这里用紫色激光激发铬橙。您可以看到,蓝色激光根本不会激发铬橙。如果我们用蓝色激光激发 V500,它会被蓝色激光激发,而用紫色激光的话,它也可被紫色激光激发。在这里用蓝色激光激发 V500,您可以看到 31% 的补偿。虽然这是由蓝色激光激发的,但在这种情况下您可以巧妙地处理数据,这样它就不会出现在蓝色激光上。它的平均值相同并且没有宽的染料载体,因此是可用的,但它是被蓝色激光激发的。一些可被双激光激发的染料有非常宽的染料载体,但却不可用,因为不会产生任何的双阳性结果,包括任何弱双阳性结果。

这是一个很好的九色样本的例子,所有抗原都表达得很好,这看起来非常好。我不打算介绍它的全部细节,但我们有与此类似的情况。这是一个十色的例子,在这里要对 CD3 进行设门。这是一个相当复杂的实验,但您可以看到这里没有 CD3 表达。这是 CD3 Qdot,我们滴定了所有的抗体,但当我们把这些抗体全部放在一起时,出现了这种结果,这不是很好的表达。所以当您把所有抗体放在一起时,有时候您需要改变浓度。此外,我们对这个也完全不满意,这不是我们想要的结果,并且这是我们选择的荧光染料有问题。如果我们增加 Qdot 浓度,这些特定细胞就能很好地表达 CD3。如果我们更换荧光染料,就会得到期望的结果。把荧光染料从 CCR7PE 换成 CCR7P-Cy7,并相应地把这里的荧光染料换成 CD4 Alexa 700,这样会使实验更加稳定。有时候您需要做一些微调。

这是每种荧光染料(即每种抗原)的单个多色百分比差异。在每次多色实验之后,您必须检查它们是否一致,确保没有任何较大误差。

下面来看补偿。如果补偿值较高,则实验的不稳定性会增加,对仪器的荧光强度(即这些光电倍增管内检测到的强度)的监测就变得至关重要。如果是低补偿,则仪器荧光强度的监测就变得不那么重要了。

最后,来看下对照的问题。我们的黄金标准是能与染色样品的阳性细胞群明确区分开的阴性细胞,这是极好的标准。其次是阴性细胞。不幸的是,现在您看到的是仪器噪音和自发荧光,而不是真正的抗体效果。这不是一个好对照,不幸的是,有时我们不得不使用它,但它不是一个好对照,您没有得到实际样品中抗体的非特异性结合。同型对照是非常常用的,它们的蛋白质浓度应该与您使用的抗体相同,这非常重要。显然,它们必须是相同的同型免疫球蛋白,并且要使用与抗体相同的荧光染料。蛋白浓度不同的同型对照不是好的同型对照,这会产生很大的误导性,还有不同的同型免疫球蛋白,甚至我们已经见过的不同的荧光染料或来自不同制造商的荧光染料。等纯系对照特别好,但很难得到正确的结果,今天暂且不提。

何时用,何时不用?选取正确的同型对照荧光素和蛋白质比例、蛋白质浓度的考量以及同型对照非常重要。这里我们看到的是一个非特异性结合的、阳性/阴性区分明确的测试抗体。只在阴性细胞上没有抗体结合。这些细胞会非常靠左,它们与抗体没有任何非特异性结合。根据蛋白质的浓度,这些同型对照可以出现在任何地方。

荧光扣除对照更适合于多色实验,但必须记住,对于荧光扣除对照,您不一定要使用高亮染料载体,因为通常您看到的是双阳性结果。在这里,可以看到我们在这里检测到的这个抗原的荧光扣除对照已经从这个管中移除了。然后我们运行装有抗体的管来检测该特异性抗原,这是结果,可以看到补偿是完美的。如果补偿不完美,并且不合适,那么得到的结果将是错误的。还是那句话,不管您做多少种颜色的实验,阳性与阴性的对照就是实际的做法。谢谢大家。

GP:    谢谢 Ian。我想这里给了大家许多值得思考的问题。相信各位都收获了一些非常重要的信息,稍后我们可以在提问环节进行回顾。不过让我们先请 Ken 给我们带来一些简要信息。


KH:    感谢 Ian 和 Graham,感谢大家参加本次网络研讨会。我想占用大家几分钟的时间,为大家介绍 Abcam 提供的一些新服务和新产品,希望对各位的研究有帮助。首先是 Abcam 的流式细胞术多色选择器工具,该工具可前所未有地简化您的多色流式细胞术实验设计。通过该工具您可以快速方便地搜索和比较 Abcam 的各种有价格竞争力的流式细胞术抗体,详情可访问 www.abcam.com/Flow-Cytometry。使用我们的多色选择器工具可以搜索和比较已通过流式细胞术验证的 2500 多种偶联一抗。其搜索范围涵盖 20 多种荧光团,其中包括 6 种串联染料。无论是查找已知的 CD 抗原还是新的标记物,所有的搜索结果都按照克隆编号进行分组,便于您确定目标产品。请访问我们的博客观看该新工具的简短教程。

Abcam 不仅提供一抗,我们还增加了蛋白质、试剂盒和染料偶联物产品,以推动各位的流式细胞术研究。此外,Abcam 还拥有一系列领先的流式细胞术实验方案、海报以及目前使用的研究方法相关文献。通过给出的链接您可以查看更多 Abcam 的流式细胞术资源。现在我将详细地介绍这类新产品中的部分产品,同时我要强调一下,在研讨会的最后我们将提供折扣代码,使用这些代码可享受七五折优惠,很多这类产品都可使用。

我们提供多种生物素结合蛋白,包括亲和素、链霉亲和素及去糖基化亲和素。这些蛋白能够可靠而稳定地结合生物素分子,因此是蛋白质检测研究中非常实用的工具。您可以任意选购与荧光团或酶偶联的产品。

流式细胞术可用于快速、可靠地分析细胞凋亡和细胞活力。在本幻灯片中,我们列出了 Abcam 提供的一些可用于通过流式细胞术检测和定量凋亡标记物的产品。例如,磷脂酰丝氨酸暴露是晚期细胞凋亡的标志,其可以通过经典的膜联蛋白 V-FITC 染色进行测定,或使用我们的 Kinetic 凋亡试剂盒。这种新试剂盒包含一种可逆探针,该探针只与暴露于外膜的磷脂酰丝氨酸残基结合,使得该试剂盒成为测量可挽救的细胞凋亡的理想工具。要了解更多关于该试剂盒以及可用于通过流式细胞术检测细胞凋亡的其他方法,请访问给出的链接。

DRAQ5 是一种可靠的 DNA 染料,可帮助您染色活细胞和已固定的细胞,其可用于流式细胞术、免疫细胞化学分析以及微阵列技术等多种平台。Abcam 新增的荧光染料产品还包括选择性标记死亡的不可渗透细胞的 DRAQ7,以及可用于检测罕见细胞活动的 CyTRAK Orange。

找不到您需要的偶联抗体?EasyLink 抗体偶联试剂盒提供快速、简单的抗体标记方法。该系列有 18 种标记物供您选择,且具有多种产品规格,使实验设计更为灵活。化学反应依赖于标记物与自由氨基的共价连接产生的完美稳定结合。我们的实验方案实际操作时间只有 30 秒,是获得所需偶联一抗的快速、经济的解决方案。大家可通过所显示的链接了解更多有关 EasyLink 的信息。

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值得高兴的是,Abcam 还提供 Alexa Fluor® 偶联二抗。目前可提供的有 Alexa Fluor® 488 和 647。从 2013 年春季起,我们还将提供 Alexa Fluor® 555 和 594。那么,为什么要选择 Alexa Fluor® 偶联二抗?我们所有的 Alexa 二抗都在内部进行了广泛的测试,确保提供良好的染色和低背景。我们有大量的预吸附抗体可供选择,确保低物种交叉反应和内源性免疫球蛋白识别。如果您想在 ICC 中使用这些产品,假设以 1/200 的比例进行稀释,可进行至少 250 次实验。可登录 www.abcam.com/Alexa 了解更多信息。

如有任何问题和疑问,Abcam 科学支持团队很高兴为您服务。我们可提供多种语言的技术支持,包括中文、日语、西班牙语、法语和德语。如果您在北美、中美或者南美,请联系我们的美国团队。如果您在欧洲,请联系我们的英国团队。如果您在中国和亚太地区,可以联系我们的香港团队。而如果您在日本,则请联系我们的日本团队。

最后,我想重点推荐几个即将举行的会议。第一个是将于 5 月在比利时布鲁日举行的“过敏和哮喘”会议。本次会议的亮点是参会者都是这一新兴领域的重要科学家。登录会议网站可以了解到更多信息,包括完整的演讲者名单以及有关演讲或海报的信息。

第二个会议是“健康和疾病中的炎症小体”学术会议。该会议将在马萨诸塞州剑桥市的哈佛大学举行,涵盖了多个主题,包括炎症小体激活的分子机制概述、IL1、IL18 及副凋亡在免疫防御系统中的作用以及炎症小体在感染性和无菌性炎性疾病中的作用研究。查看网站了解更多详细信息,包括已确认的演讲者名单以及他们的演讲主题。


希望今天的研讨会能帮到大家。即将举行的几个网络研讨会包括 2 月 28 日举行的“荧光蛋白印迹:介绍和应用”,以及 3 月 6 日举行的“单一标记和多标记 IHC/ICC 染色技术”。现在,我要把时间交还给我们的主讲人,由他来回答大家在研讨会期间提交的问题。

GP:    谢谢 Ken,太精彩了。好的,那么我们花几分钟时间来看一下通过界面发过来的一些问题。我想每个人都从今天的会议中收获了一些关键的信息,我也记住了三点,主要就是,在特定的实验中铬的特定流量强度不一定会直接影响所需的补偿量。如果您使用荧光染料套装,了解该套装在多大程度上受到多种激光激发也是非常关键的,因为将荧光染料套装放在一起会对您的决策过程产生重大影响。Ian 提出的另一个有趣和关键的因素是,如果您在单色实验中滴定抗体,则需要确保在多色实验中使用该抗体浓度可获得相同的值,因为您可能需要更改使用的抗体稀释倍数。

这里我们收到了一些问题,其中一个是 PeCy5 是否是最好和最亮的荧光团,而 APC-H7 是最差的?这里我强调下,您需要做的是掌握您个人实验的主导权,因为在某些实验中,某个特定组合或某个特定荧光染料会比其他的更好。所以很抱歉,我认为这个问题没有固定的答案,但是使用何种染料应该基于您对仪器配置的全面了解以及您想要进行的实验。好了吗,Ian?

ID:    第二个问题:是不是任何超过 35% 的补偿值都是不可接受的,例如在 FL9 和 FL10 之间?这个不是的,您不能用补偿的有限值来限定什么是可接受的,什么是不可接受的,因为您必须要考虑您的荧光染料、您要达到的目的以及您仪器上的滤光片。但我想说的是,应该将补偿值保持在尽可能低的水平。就我个人来说,我从未使用超过 80% 或 90% 的补偿,因为我认为这会变得不稳定。这也意味着,如果您的补偿超过 100%,那么坦白说,当你在一个 PMT 中测定荧光染料并试图通过另一个 PMT 来补偿时,则需要对其重新测定。所以,我们从来没用过超过 100% 的补偿,而且我们试图将所有补偿值尽可能降低。但是,容我再次强调,您需要确保您的补偿值尽可能低,并且需要在实验中采取其他的方法,这样才能尽可能地保持低水平。但是 35% 的补偿就很好了。

GP:    来看另一个问题:我们怎么知道何时准备的补偿较好? 我觉得有张图可以胜过千言万语,我认为有一些实验数据 — Ian 出示的实际实验数据,肯定能清楚地说明这一点。这是一个设置了正确对照物的示例,并且知道单染色细胞是什么样的,当使用抗体组合时可确保您得到的数据和阳性百分比相同。另外,一般来说,在你们所看到的两个通道中,单染色细胞会有明显区别。概括地说,情况基本上都发生在方形区,如果您得到的是方形图像,那么这通常意味着您获得了正确的补偿设置。但是,同样的,设置所有实验的关键对照以及了解仪器的工作原理十分重要。

ID:    来看下一个问题:更亮的荧光染料总是具有比较暗的荧光染料更低的光谱重叠吗?不,并不是这样的,这个问题不妨这样说,如果使用较暗的荧光染料来设置补偿,那么得到的误差范围会更大。荧光染料越亮,在将阴性细胞群中值调成阳性细胞群中值时就越准确。相比于使用较暗的荧光染料,所处理的荧光染料越亮、数量越多,就能在当天结束时获得更准确的结果,因此这种说法是不对的。

GP:    下面一个问题是:串联染料的分子是否应该更大,分子大小会妨碍染料渗入细胞吗?本质上讲,串联染料显然是两种荧光团通过共价结合偶联在一起的,那么问题是分子大小会阻碍染料内化到细胞中吗?答案是否定的,因为这些分子的大小在这种实验中是不受限制的。

相反,另一个真正的问题是串联染料是否适合或不适合细胞内实验?在这些实验中,固定和透化过程对这些串联染料的功能有影响吗?是有一些串联染料在细胞内实验中表现不太好,比如 PeCy7。但我认为,对于大多数其他染料,这将受到多种因素的影响,它在很大程度上取决于您在实验中所分析的细胞。所以,再次重申,您需要了解系统并进行一些初步实验以确保实验设置符合我们的目的。

与此相关的另一个问题是补偿或补偿需要是否受到存在的固定细胞的影响?那么不是的,这不会受到影响,因为补偿与荧光特征有关,而不是细胞状态。虽然,很明显,如果您的实验设置如 Ian 在他其中一张幻灯片中介绍的那样,也就是以不正确的方式保存细胞,那么您的串联染料可能会降解,届时你可能才开始注意到补偿问题。但是,如果实验处理正确并且细胞保存得当,那么就不会有任何问题。

ID:    我们对此有一些疑问并不奇怪。下面一个问题: 为什么我们会有这么多关于串联染料的问题,该如何解决这些问题? 解决方法非常简单,就是小心处理这些染料。我倾向于不在任何已添加串联染料的实验中加入固定剂,但是串联染料种类非常多,比如 PerCPCy5.5,它几乎就像单一荧光染料一样,确实非常地稳定。而另一方面,PeCy7 可能存在一些问题。但即使是 PeCy7,如果处理得当,例如没有将它在工作台上放置太久,或样品分析相当快,几个小时内就准备好样品,那么这也不是问题。所以我想说,串联染料获得这个不太好的名声是不合理的。很多串联染料是绝对好用的,您会经常需要使用它们,但也可以找到替代品。


至今仍有人没有跳出条条框框,只是一味地使用同一种染料。以 Alexa 532 为例,如果使用的是绿色激光,这将会是一种很好的染料。但如果使用的是紫外激光,那么 Alexa 350 会是最佳选择(虽然通常没有人会用它),而且这是一种非常好的分型染料。所以,打破陈规您就会拥有更多选择,有时也可以不使用串联染料。但是,就像 Graham 先前所说的那样,还要考虑使用什么样的激光激发染料,是单激光还是双激光,因为如果您正在寻找双阳性染料载体,那么要着重考虑弱双阳性细胞。这才是主要的考虑因素,而不是试图避免在多色实验中使用串联染料。

GP:    下面是一个关于对照的问题:您是否使用同型对照或荧光扣除对照来确定阴性细胞群?同样,在某种程度上,这取决于你的实验设置。就个人而言,我们倾向于两者都使用,因为它们提供了不同类型的信息。但我要重申一下 Ian 之前说过的,就是如果您使用同型对照,那么需要确保同型对照的浓度与所用的抗体浓度相同。最好是从同一家供应商处购买一抗,因为您需要确定所要进行比较的偶联体系是完全相同的。荧光扣除对照也是一个很好的测试手段,因为它能让你了解这类抗原的作用,或目标抗体周围的抗体对目标细胞群产生了何种影响。特别是如果你发现了弱表达抗原或者弱表达抗原的诱导,你需要确定得到一个已经被多色套装补偿了的信号。

所以,对于很多这类问题并没有明确的答案,但这确实对了解实验有帮助,需要确保这些可使我们对于结果的分析 100% 自信的所有对照全部到位。

ID:    下面这个问题跟幻灯片中的内容有关,这个问题问在三色示例中,为什么 CD3 和 CD8 阳性细胞的设置完全不同? 其实只要可以知道哪些是阴性细胞群,并且阳性和阴性细胞群之间的界限明显,那么怎么设置并不重要。所以,我的意思是,这是相当随意的。如果在美学上,你更喜欢把细胞门调低,那也没关系,但是要记住如果降低门控后,阴性结果中出现有任何弱阳性结果,那么这些结果就报废了。因此,实际的 PMT 设置应基于抗原的实际最大表达,以便可以绝对地看到所有阳性事件。现在,如果弱阳性结果超出了界限并且只研究非常明亮的事件,您可以把它们放在任何想要的地方,因为这不会影响结果。但是如果你是在观察暗淡的 CD3 或暗淡的 CD8 事件,在降低 PMT 电压时就要非常小心,因为你可能会丢失一些暗淡的事件。

GP:    谢谢 Ian。下面我将把时间交还给 Lucy,但在此之前请允许我代表 Ian 和我自己感谢各位参加今天的研讨会。抱歉的是,由于时间有限,我们未能回答所有的问题,但我们已经收到了这些问题,我们会线下尽快回复各位。Lucy?

谢谢。首先,我要感谢 Ian、Graham 和 Ken 为我们带来了本次网络研讨会,同时我谨代表 Abcom 感谢各位的参与。正如 Graham 所说,对于问题尚未得到回复的听众,我们将尽快与您联络并进行解答。也可下载本网络研讨会的 PDF 文件,当您退出本次网络研讨会时,界面将跳转到一个网页,该网页提供 PDF 文档下载以及具体的网络研讨会促销活动相关内容。如果您对今天所讲的内容有任何疑问,或者需要任何科学咨询,请不妨通过 technical@abcam.com 联系我们的技术支持团队,他们会非常愿意帮助您。最后,希望您通过本次网络研讨会收获到有用的信息,欢迎您以后参加其他网络研讨会。再次感谢各位的聆听,祝各位的研究顺利。


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