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选择合适二抗的重要性

了解可能影响二抗特异性、灵敏度和一致性的多种因素。

二抗通常在各种免疫分析(例如蛋白质印迹、免疫组化和免疫细胞化学或细胞成像)中用作检测试剂。但选择适合二抗的重要性有时却会被忽略。

二抗与其他抗体一样,其被设计为靶向特异性抗原。所有二抗的靶标都是免疫球蛋白 (Ig),因此其能够结合一抗并用作免疫分析的检测试剂。所以在为实验选择适合一抗时需要考虑的诸多因素同样也适用于二抗的选择。为实验选择合适的二抗,能大大改善您的检测结果。相反,二抗问题所产生的不利影响和一抗的相当。主要通过三项参数确定抗体性能:

  • 特异性:指抗体识别对应靶抗原但不识别结构类似抗原的程度。该参数对二抗尤为重要,原因是其靶抗原为免疫球蛋白,其不同类型乃至物种之间的同源性通常较高。
  • 灵敏度:指抗体能够检出的抗原量。灵敏度不仅取决于二抗的结合亲和力(通常较高),标记本身以及抗体标记程度也很关键。
  • 一致性:指使用不同批次抗体执行分析时,结果几乎没有差异。一致性主要受抗体来源及其克隆状态的影响。

二抗性能受许多因素的影响,因此研究人员通常会在各种不同备选抗体中进行选择,以确保得到最佳结果:


类型

考虑事项

宿主物种

  • 山羊和驴:最常用的宿主物种,常用于制备多克隆抗体。
  • 小鼠和大鼠:常用于制备单克隆二抗。
  • 其他:兔、绵羊、鸡等。
  • 有时可根据个人偏好选择宿主物种,就我们的经验来看,不同物种制备的二抗在品质上没有多大差异。
  • 使源于二抗宿主物种的血清进行封闭,可显著降低背景。
  • 一般来说,用于多标记的所有二抗都应来自相同的宿主物种。

抗体形式

  • 完整抗体。
  • F(ab):用木瓜蛋白酶酶解获得的抗体片段。
  • F(ab’)2:用胃蛋白酶酶解获得的抗体片段。
  • 较小的抗体片段能够更加高效地渗透组织,该特点对免疫组化等特定应用非常有利。
  • 使用抗体片段可减少抗体 Fc 部分与细胞上 Fc 受体之间的非特异性结合,这一点在分析 Fc 受体含量高的特定组织(例如,脾)时非常有帮助。

偶联物

  • 酶促:HRP(更稳定)和 AP(更灵敏)。
  • 荧光:Alexa Fluor® 染料、FITC、PE、APC、花菁染料等
  • 蛋白质:生物素。
  • 其他:金颗粒、磁珠或聚合物。
  • 偶联物的选择会对抗体灵敏度产生极大的影响。
  • 荧光偶联物的亮度不同。
  • 生物素偶联物有利于放大信号,聚合物的酶促偶联物或荧光偶联物也有利于放大信号。

靶蛋白 (Ig)

  • 重链:γ(IgG 和亚类 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4)、μ (IgM)、α(IgA 和亚类 IgA1 和 IgA2)、ε (IgE) 和 δ (IgD)。
  • 轻链:κ (kappa) 和 λ (lambda)。
  • 不同物种的 Ig 结构极为类似,针对某一物种 Ig 的抗体可能会与多种其他物种的 Ig 发生交叉反应,除非该抗体已特异性吸附了能够发生交叉反应的物种的 Ig。
  • 二抗应与所选一抗的类型和亚类匹配,对单克隆一抗来说更是如此。
  • 亚类特异性抗体专门用于在多标记实验中区分不同亚类的小鼠 IgG 一抗。
  • 如果一抗的类型和/或亚类未知,则可使用抗小鼠 IgG,其能够识别大部分小鼠 IgG 亚类。

特异性

  • H&L:重链和轻链(即,Fc 和 F(ab)/F(ab’)2)。
  • 重链或轻链:仅与重链或轻链反应。
  • Fc:与重链的恒定区反应。
  • 铰链重链:与重链的铰链区反应。
  • α、δ、ε、γ 或 μ 链:仅与拥有特定同型的重链反应。
  • F(ab) 或 F(ab’)2:仅与抗体片段反应。
  • 大部分多克隆二抗的靶标都是重链和轻链。
  • 以轻链为靶标的二抗将结合至任意 IgG 类型或亚类(因为其共用轻链)。

同型

  • 重链:γ(IgG 和亚类 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4)、μ (IgM)、α(IgA 和亚类 IgA1 和 IgA2)、ε (IgE) 和 δ (IgD)。
  • 轻链:κ (kappa) 和 λ (lambda)。

特定情况下,二抗本身的同型也是很好的选择。例如,小鼠体内产生的同型为 IgG2a 的抗体能够与人白细胞紧密结合。

克隆状态

  • 多克隆:结合多个表位,因此灵敏度更高,但会影响特异性。
  • 单克隆:识别单一表位,因此可生成具有高度特异性的抗体,但会影响灵敏度。

针对一抗的各克隆状态的优势和局限性,也同样适用于二抗。

纯化

  • 亲和纯化。
  • 预吸附:将含有二抗的溶液通过固定有血清蛋白(源自可能发生交叉反应的物种)的色谱柱填料。非特异性二抗将保留在色谱柱内,而具有高度特异性的二抗将流出色谱柱。示例:将含有可识别兔 IgG 的二抗溶液通过固定有绵羊和牛 IgG 的填料。只有那些对兔 IgG 具有高度特异性的抗体才能够流出色谱柱,而与绵羊或牛 IgG 发生交叉反应的二抗将与色谱柱内的蛋白质结合而被保留。
  • 大部分偶联二抗均可通过亲和色谱法纯化。
  • 预吸附(交叉吸附)的二抗已经过附加纯化步骤,因此其特异性提高且交叉反应风险降低。
  • 在使用吸附有源自亲缘关系较近物种抗体的二抗时,因为其表位识别能力已大幅下降并且可能对某些单抗的识别能力较差,选择时需特别谨慎。

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Alexa Fluor® 是 Life Technologies 的注册商标。Alexa Fluor® 染料偶联物包含由 Life Technologies 授权给 Abcam 的技术。


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