All tags secondary-antibodies 荧光WB实验方案及如何使用 IRDye® 二抗

荧光WB实验方案及如何使用 IRDye® 二抗

获取您的荧光WB方案。了解如何使用IRDye®二抗,封闭,抗体稀释,孵育时间,洗涤步骤和成像以获得荧光免疫印迹中清晰的条带。

应用IRDye® 二抗的荧光蛋白印迹是可以定量的,并且提供比基于酶的方法更宽的动态范围,使其成为量化相对蛋白质丰度的最佳选择。 有关样品制备,运行凝胶以及将凝胶中的蛋白质转移至膜上的指导,请参阅我们的常规western blot方案

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封闭与一抗孵育

将膜浸没在高质量的TBS based 封闭缓冲液(BB)。孵育1小时。
使用稀释液(50%BB,50%TBS 0.1%吐温20(TBST))稀释抗体。
将膜浸没在10ml配好的一抗孵育液中,放在摇床上孵育。建议使用浓度梯度时间梯度来确认最佳稀释比例和孵育时间。

  1. 将膜浸没在高质量的TBS based 封闭缓冲液(BB)。孵育1小时。
  2. 使用稀释液(50%BB,50%TBS 0.1%吐温20(TBST))稀释抗体。
  3. 将膜浸没在10ml配好的一抗孵育液中,放在摇床上孵育。建议使用浓度梯度时间梯度来确认最佳稀释比例和孵育时间。


洗膜并准备二抗

  1. 去除一抗孵育液并开始洗涤步骤。
  2. 洗膜液使用 TBST,先快速冲洗2次,然后充分洗膜3次,室温,每次15分钟。
  3. 洗膜时,配置二抗孵育液,根据建议(见下表1)稀释二抗。确保二抗孵育液充分混匀。 荧光二抗都是光敏感的,孵化时应避光。
  4. 去除TBST并孵育二抗,放置在摇床上,避光孵育1小时。
  5. 孵育后,去除二抗孵育液,重复第2步的洗膜步骤。

1:二抗与稀释度 ​​

一抗宿主物种 货号 二抗名称 建议稀释比例
Rabbit ab216773 Goat anti-Rabbit IgG H&L (IRDye® 800CWpreadsorbed  1:10,000
ab216777 Goat Anti-Rabbit IgG H&L (IRDye® 680RD 1:10,000
Mouse ​ab216772 Goat anti-Mouse IgG H&L (IRDye® 800CWpreadsorbed 1:10,000
ab216776 Goat anti-Mouse IgG H&L (IRDye® 680RDpreadsorbed  1:10,000

查看其它IRDye®抗体


成像

  1. 使用无绒棉布沾取70%乙醇清洁扫描区。 
  2. 如果扫描干燥的膜,将膜放在两张滤纸之间,并用箔片覆盖,在工作台上放置过夜。将蛋白面朝下放置在扫描区,膜上方压上硅胶垫,以确保膜平放在玻璃上。不需要滚筒。 
  3. 如果扫描湿润的膜,则蛋白面朝下放置在扫描区,滴取5ml TBST覆盖整个扫描区。在膜上放置硅垫,用滚筒去除气泡。 组蛋白检测用湿膜扫描效果很好。 
  4. 盖上设备,根据设备使用说明进行相应的扫描。扫描后,将膜取下,并使用无绒棉布沾取70%乙醇清洁扫描区。


>>阅读下一篇:成功的荧光蛋白印迹的提示和技巧

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