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流式细胞术 – 实验设计和样品前处理

有关流式细胞术对照物选择和样品制备的提示

在现代生物医学研究中,流式细胞术是一项非常有价值的技术。这项技术广泛用于细胞群的表征和蛋白质标记物的表达分析。但是,欠考虑的实验设计可能会导致实验结果作废。本文旨在为您提供有价值的提示,帮助您设计实验和制备样品。

实验设计 - 全面的方法可以使您事半功倍

​​

  • 通读文献,并且要精读与您的样品和实验相关的部分。做好基础工作可避免在后续研究中出错。
  • 确保您的仪器能够准确检测出目标荧光团。请选用亮度最高、溢出最少的荧光团,您可以尝试我们的新产品 — Alexa Fluor® 偶联二抗,已经过验证其适用于流式细胞术。
  • 确保您所需的试剂齐全。制定分步实验方案,并计算样品数所需的试剂量。
  • 由于死细胞的存在会显著影响分析结果,因此您可能需要使用死细胞标记物。目前我们提供多种适用于检测的死细胞标记物。
  • 通过抗体滴定实验找到最适的稀释倍数并最大程度降低背景。可将数据表中提供的工作稀释倍数用作测试起始点。
  • 选择适合您预期的研究对象。例如,细胞系由相对同质的细胞组成,而原代细胞通常由不同细胞类型的异质细胞群组成。

对照物

对照物

所含物质

目的

说明

未染色对照

经过完全处理而未添加任何抗体的细胞。

用于检测自发荧光,也可用作额外的阴性对照。

与微珠相比,有助于确定自发荧光的相对量。如果自发荧光水平过高,可考虑使用不同的激发光源。

内部阴性对照

不表达目标抗原且经过完全处理的细胞群。

用于避免非特异性结合产生的假阳性结果。

有时候获得阴性对照细胞并不容易。理想情况下,内部对照的荧光强度应与未染色对照一致。

同型对照

与同型对照抗体一同培养的细胞(细胞中不应包含由某种抗原产生的抗体)。

用于检测一抗的非特异性结合。

同型对照至少应与一抗或二抗的重链(IgA、IgG、IgD、IgE 或 IgM)匹配,并且可与相同的荧光团偶联。

二抗对照

仅用二抗培养的细胞。

用于检测二抗的非特异性结合。

仅当使用二抗时需要。

阳性对照

表达所关注靶标的细胞。

用于避免错误抗体产生的假阴性结果。

有时候获得阳性对照细胞并不容易。

样品制备

  • 将 BSA 或 FBS 用作封闭剂,以最大程度减少非特异性结合。
  • 使用不含 Ca/Mg++ 的缓冲液可防止阳离子依赖型细胞粘附。可以添加最高 5 mM 的 EDTA 防止细胞粘附。此情况下,由于未透析的 FBS 会取代 Ca/Mg++,因此应使用 BSA (0.1 – 1%) 或透析的 FBS (1 – 5%)。
  • 若要研究细胞内标记物,可以使用低浓度的非离子型洗涤剂(最高 0.1%)透化细胞膜。
  • 样品染色过程中,使用 10% 同源血清或 5 mg/mL 未标记 IgG 可最大程度避免抗体与 Fc-受体结合。
  • 处理活细胞时,为防止细胞表面蛋白内化,所有步骤应在冰上进行。使用前将试剂保存在 4 °C 的环境。由于胰蛋白酶会诱导细胞表面蛋白的内化,需要采用温和的方法分离粘附细胞系。
  • 加入 DNAse I (25 – 50 µg/mL) 和 5 mM MgCl2 可避免细胞死亡产生的团块。
  • 获得单细胞悬液非常重要,可以避免系统堵塞。必要时,检测前用细胞滤网帽过滤样品。仅用尼龙网作最后过滤即可,否则系统会损失较多样品。
  • 细胞浓度应维持在合理的范围 (1 x 106 – 10 x 106 细胞/mL),浓度过高可能会堵塞系统并影响分离。
  • 为防止细胞损伤,应避免出现气泡、过度涡旋、更换缓冲液时吸出全部溶液、过度离心。



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