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采用间接方法进行双重或三重标记通常使用来源于不同物种的一抗,但使用在同一物种中产生的一抗进行多重标记也有一定可能性。一抗的作用被随后加入的与不同荧光团偶联的二抗显示出来。以下是使用二抗进行双重或三重染色时需要记住的一些基本技巧:
我们的 Alexa Fluor® 二抗系列产品提供了 9 种不同的染料,这些染料具有最小的光谱重叠,同时覆盖整个光谱。下表展示了我们提供的 9 种 Alexa Fluor® 染料之间的相容性。
不同 Alexa Fluor® 染料之间的相容性用高(绿色)、中(橙色)或低(红色)表示。相容性高表示荧光团之间不存在串扰。由于相容性低的荧光团之间存在高串扰,因此应尽可能避免在同一实验中使用。
Alexa Fluor® 染料是目前最明亮和最耐光的标记物。我们的 Alexa Fluor® 偶联二抗具有以下特点:
举例来说,以下是根据上述建议使用二抗进行的双重免疫染色实验的图像。
图像:由 UMDNJ-Robert Wood Johnson 医学院的 Shaohua Li 博士提供
样品:小鼠胚胎干细胞分化的拟胚体 (EB)
复染:DAPI
抗体 | 抗原 A — Laminin | 抗原 B — Ki67 |
一抗 | 抗 Laminin α1 的兔多克隆抗体 | 抗 Ki67 的小鼠单克隆抗体 |
二抗 | 山羊抗小鼠 IgG H&L (Alexa Fluor® 488) 预吸附抗体 (ab150117) 与鸡、牛、马、人、猪、兔和大鼠具有最小的交叉反应。 | 山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor® 594) 预吸附抗体 (ab150084) 与人、小鼠和大鼠具有最小的交叉反应。 |
注意:在本例子中,两个二抗均在山羊中产生,因此不会彼此识别。两个二抗也均经过预吸附,因此不会识别其他一抗以及组织中可能存在的内源性小鼠免疫球蛋白。
Alexa Fluor® 是 Life Technologies 的注册商标。Alexa Fluor® 染料偶联物包含由 Life Technologies 授权给 Abcam 的技术。