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直接和间接免疫荧光

了解直接与间接免疫荧光方法之间的差异。

免疫荧光 (IF) 或细胞成像技术使用抗体将荧光染料(也称为荧光素或荧光物)标记到特异性目标抗原上,所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素 (FITC) 等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于IF实验中。

荧光素的使用使得用户通过荧光显微镜(例如表面荧光显微镜和共聚焦显微镜)观察样品中的靶标分布情况。根据荧光素与一抗还是二抗偶联,我们将 IF 方法分为两类:

  • 直接 IF-使用单个抗体,该抗体直接指向目的靶标,一抗与荧光素直接偶联。
  • 间接 IF-使用两个抗体,一抗未偶联,荧光素偶联的二抗指向一抗,并用于检测。



下图描述了直接和间接方法。

如下表所示,两种方法各有利弊。


直接

间接

时间

直接 IF 的实验方案通常较短,因为它只需要一个标记步骤。

使用偶联二抗检测一抗会增加额外的操作步骤。

成本

偶联一抗通常比未偶联一抗更贵。

与一抗相比,二抗相对更便宜。使用相同的偶联二抗检测不同的一抗能进一步节约成本。

复杂度

直接方法的实验方案步骤较少,更简单。

间接方法中必须选择适当的二抗,增加了复杂度。这种情况在需要使用多个二抗的多色实验中尤为突出,每个二抗需要靶向不同的物种并偶联至不同染料。

灵活性

市场上可获得的偶联一抗限制了灵活性。

不同偶联二抗的可用性大大增加了灵活性。

灵敏度

直接方法中获得的信号与间接方法相比可能较弱,因为直接方法中没有使用二抗进行信号放大。

多个二抗结合一抗可使信号放大。

物种交叉反应性

直接方法中,物种交叉反应被降至最低,因为荧光素已经与一抗偶联。

二抗可能与不是靶标的生物体发生交叉反应。使用预吸附二抗能防止交叉反应。

背景

使用偶联一抗可减少非特异性结合。

间接方法中,含有内源性免疫球蛋白的样品可能显示高背景。

直接和间接方法不仅仅限于免疫荧光。它们也与其它依赖于荧光素偶联抗体的技术相关,例如流式细胞术、ELISA 和免疫组化。

检测低丰度蛋白有时很困难,间接检测法也不例外。生物素修饰的抗体可以在原抗原-抗体复合物之外额外增加一层蛋白结合,从而达到信号放大的作用。了解更多关于生物素偶联抗体如何使用的方法,点击此处

利用我们的成像试剂资源指南扩展您的知识。

​Alexa Fluor® 是 Life Technologies 的注册商标。Alexa Fluor® 染料偶联物包含由 Life Technologies 授权给 Abcam 的技术。